约50%的骨髓增生异常综合征（MDS）患者存在剪接因子突变，包括SF3B1、SRSF2、U2AF1等。不同剪接因子突变引起剪接异常的机制有所不同，但最终能导致相似的MDS表型，提示剪接因子突变可能导致不同于剪切异常的共同致病通路。近期研究发现，SF3B1、U2AF1、SRSF2突变能导致R-loop积累，引起DNA损伤及修复异常，并激活ATR-Chk1通路，最终导致细胞凋亡和肿瘤发生。文章就R-loop在MDS中的发病机制及相关靶向治疗药物的研究进展进行综述。
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骨髓增生异常综合征（MDS）是一种起源于造血干细胞的高度异质性克隆性疾病，特征是无效造血、外周血细胞减少以及高风险向急性髓系白血病（AML）转化[1,2,3]。随着高通量测序技术的发展，已经证实基因突变在MDS的发病机制中起重要作用，其中，剪接因子突变因主要发生在MDS而引起较多关注。剪接因子突变改变了细胞的剪接过程，不同剪接体蛋白改变了不同转录组的剪接，但最终能够引发相似的MDS表型，提示剪接因子间可能存在一段共同致病通路[4]。研究发现，SF3B1、U2AF1和SRSF2突变均诱导R-loop增加[4,5,6]。R-loop抑制剂并不能逆转剪接因子突变诱发的选择性剪接事件，且剪接因子突变诱发的R-loop积累并不发生于选择性剪接处，提示剪接因子突变引起RNA剪接异常和R-loop积累是两个独立的过程[7]。因此，R-loop积累可能是剪接因子突变共同的致病通路之一，阐明R-loop在MDS中的发病机制并靶向R-loop上下游相关靶点，可能为MDS患者提供新的治疗策略。
R-loop是由DNA：RNA杂交体与一条非模板链组成的三链结构，常发生在转录过程中，主要存在于基因组的中心体、端粒、转录起始和终止点附近。近年来，通过不断深入的研究发现，R-loop对基因表达调控、类开关重组、DNA修复等正常细胞过程起着重要的作用[8]。然而，R-loop是细胞内导致基因组不稳定的主要原因之一，异常的R-loop积累会引发基因组不稳定，导致肿瘤发生。正常细胞存在识别并降解R-loop结构的机制，例如通过核糖核酸酶RNase H特异地清除DNA：RNA杂合链中的RNA以降解R-loop。
近年来，多个研究显示剪接因子突变诱发MDS细胞R-loop积累。Chen等[5]发现，SRSF2突变蛋白将失去从7SK复合物中提取正转录延长因子复合物（p-TEFb）的能力，影响转录本释放，进而引起R-loop水平升高和转录终止。为了进一步检测R-loop水平升高引起的下游反应，Singh等[6]发现SF3B1K700E突变的K562细胞γ-H2AX foci数量增加（DNA损伤标志），且当细胞表达过量RNase H1时，γ-H2AX foci数量减少，表明在携带SF3B1突变的细胞中，R-loop水平升高导致DNA损伤。除此之外，携带SF3B1K700E突变的细胞Chk1 Ser345磷酸化水平升高，标志着ATR通路激活[6]。Nguyen等[4]构建表达U2AF1WT和U2AF1S34F的Hela细胞，发现复制蛋白A磷酸化（p-RPA）水平明显升高。RPA是一种结合单链DNA（ssDNA）的异三聚体复合物，在DNA复制和修复中具有多种功能[9]。当DNA损伤时，RPA包被ssDNA作为招募ATR检查点激酶及其调控因子和底物的平台[10]。当在U2AF1S34F的Hela细胞过表达RNase H1或使用ATR抑制剂时，p-RPA水平减低，表明U2AF1S34F以R-loop依赖的方式激活ATR通路[4]。以上研究结果表明，剪接因子突变诱发R-loop积累，引起DNA损伤，进而激活ATR通路。由于R-loop的生理、病理功能复杂，靶向R-loop上下游通路可能是新的治疗方向。
根据MDS诊治指南，宜根据修订版国际预后积分系统（IPSS-R）危险度分层进行个体化治疗，常规药物包括免疫调节剂沙利度胺、免疫抑制剂如环孢素A、去甲基化药物阿扎胞苷和地西他滨及支持治疗药物等，异基因造血干细胞移植仍是目前唯一能根治MDS的方法。由于MDS好发于中老年人，仅约10%的患者能接受移植，不适合移植的MDS高危患者总体预后较差[11]。随着R-loop在MDS、AML等血液系统肿瘤中的作用逐渐被阐明，靶向R-loop的药物也处于不断研发中，主要包括剪接体调节剂、ATR抑制剂和Chk1抑制剂。
剪接是去除前体mRNA中的内含子，连接外显子产生成熟mRNA的过程，该过程需要剪接体参与。剪接体是一个大型的蛋白质-RNA复合体，由U1、U2、U4、U5和U6共5种核小RNA（snRNPs）以及300多个非snRNP蛋白组成。目前，处于研究热点的剪接体调节剂主要有E7107、H3B-8800、Pladienolide B（Plad-B）等。
E7107是自然真菌产物Plad-B的衍生物，通过抑制剪接体组装调节蛋白表达，在临床前试验中表现出独特的抗肿瘤作用[12]。E7107针对SF3B1复合物的剪接调节分子，诱导内含子保留等剪接改变。Nguyen等[4]用E7107处理Hela细胞后发现R-loop水平升高，联用ATR抑制剂能够进一步增加R-loop水平，且E7107能增加细胞对ATR抑制剂的敏感性，从而加重DNA损伤。此外，E7107还能增加细胞对化疗药物的敏感性[13]。研究证明，E7107可通过增加bcl2依赖性并诱导其他bcl2家族蛋白的错接使慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞对维奈克拉敏感性增加[14]。两项关于E7107在实体肿瘤的Ⅰ期研究（NCT00499499、NCT00459823）均由于少数患者出现严重视力下降而终止，尽管不良反应可以逆转，但仍限制了E7107的应用[15,16]。
E7107的衍生物H3B-8800，通过干扰SF3B复合体和分支点区域之间的相互作用来调节剪接，可与SF3B复合物竞争性结合而优先杀死SF3B1突变细胞。H3B-8800对带有SF3B1K700E的K562细胞具有优先杀伤作用[17]，提示H3B-8800作为一种新型的剪接调节剂可能在肿瘤治疗中显示出更好的疗效。目前，H3B-8800已经进入临床Ⅰ期试验阶段（NCT02841540）。
Plad-B是一种源自链霉素的剪接调节剂。Kashyap等[18]发现，Plad-B具有明显诱导内含子保留的特性，可通过caspase依赖性机制诱导不可逆的CLL细胞早期凋亡。Matos等[19]发现，Plad-B能够增加R-loop、ssDNA和p-Chk1水平，Jann等[20]将Plad-B与ATR抑制剂联合用于MDS CD34+细胞，结果显示，Plad-B能够进一步增加携带剪接因子突变的CD34+细胞对ATR抑制剂的敏感性。因此，联合使用剪接体调节分子和ATR抑制剂可能为剪接因子突变的肿瘤患者带来更好的治疗效果。目前，Plad-B尚未开展临床试验，仅作为一种潜在抗肿瘤药物。
ATR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由于DNA处于不断遭受内源或外源性损伤的状态中，为了防止DNA复制错误，真核生物启动DNA损伤反应（DDR）以修复DNA，ATR是该反应的核心蛋白激酶之一[21]。研究表明，剪接因子突变的细胞会引起R-loop水平升高，DNA复制压力增大和DNA损伤，进而激活ATR-Chk1通路使细胞周期停滞，启动DNA修复，使突变细胞存活。因此，抑制ATR-Chk1通路，使肿瘤细胞不能启动修复而直接凋亡成为肿瘤治疗的新方向。
M6620（VE-822/VX-970）是第一种进入临床试验的ATR抑制剂，主要用于小细胞肺癌等实体瘤的治疗。M6620单药或联合顺铂、吉西他滨等在实体肿瘤中显示出良好的治疗前景[22]，目前尚缺乏血液系统肿瘤的应用研究。
AZD6738在血液肿瘤中的治疗研究较为广泛，多项Ⅰ~Ⅱ期临床研究正在进行，包括单药治疗（NCT01955668、NCT03770429）、联合紫杉醇（NCT02630199）、阿卡替尼（NCT03328273、NCT03527147）等，在实体瘤的临床试验研究中还与放疗（NCT02223923）、地西他滨（NCT03669601）、PARP抑制剂（NCT03878095）等联合应用。
Chk1即检查点激酶1，也是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，表达水平常与肿瘤分级和疾病复发呈正相关，在DNA损伤时促进周期阻滞[21,23,24]。ATR和Chk1能避免细胞在复制受到干扰时进入有丝分裂[25]。在DNA过度或持续损伤时，检查点信号能够触发凋亡，避免异常遗传信息传播，从而维持基因组稳定性[24]。化疗和放疗通过产生大量DNA损伤来杀死肿瘤细胞，同时也激活了Chk1依赖的DDR反应来促进细胞存活，因此抑制Chk1使细胞无法启动DNA损伤修复，可能增强化疗和放疗的疗效[26]。
Ⅰ期临床试验（NCT00907517）已经证实MK-8867（SCH 900776）联合阿糖胞苷治疗复发难治AML患者是可行的[27]。在此基础上，一项随机化Ⅱ期研究（NCT01870596）使复发难治AML患者分别接受MK-8867联合阿糖胞苷（14例，ArmA组）和阿糖胞苷单药治疗（18例，ArmB组），ArmA组中5例（36%）取得完全缓解，1例（7%）获得部分缓解，ArmB组分别为8例（44%）、1例（6%），两组中位总生存时间差异无统计学意义。MK-8867并没有改善反应率和生存率，且由于脱甲基作用导致其在体内的稳定性有限，该药物已经停止开发[28]。
Chk1抑制剂prexasertib（LY2606368）在三阴性乳腺癌、卵巢癌等实体肿瘤中得到广泛研究，多项临床Ⅰ~Ⅱ期试验正在开展。有研究采用prexasertib、伊马替尼、达沙替尼单药以及prexasertib+伊马替尼、prexasertib+达沙替尼、prexasertib+氯法拉滨处理各种B/T细胞源性急性白血病细胞株，证实prexasertib与伊马替尼、达沙替尼及氯法拉滨联合使用对细胞活性的抑制效果均优于上述药物单独使用[29]。目前，prexasertib单用或联合治疗成为白血病、MDS等血液系统肿瘤领域的研究热点，同时联合阿糖胞苷、氟达拉滨（NCT02649764）的三联疗法以及联合阿糖胞苷、米托蒽醌、依托泊苷（NCT03735446）的四联疗法正在研究中。
随着对剪接因子突变引起疾病发生、发展的机制研究不断深入，针对剪接因子本身及其下游靶点调节的药物正处于不断开发和研究中。剪接调节剂、ATR和Chk1抑制剂无论是在单用或与其他放化疗药物等联合使用，都显示出良好的抗肿瘤活性，具有十分乐观的前景。目前，多项临床Ⅰ~Ⅱ期阶段研究正在进行，但主要针对实体瘤患者，针对血液系统肿瘤的治疗研究尚不足。多项临床前研究已经证实，上述药物的联合使用增加肿瘤细胞的敏感性并改善患者耐受性，未来将进一步探索最佳的给药剂量及联用方法，以使患者获得最佳治疗效果，降低复发率及改善预后。
所有作者均声明不存在利益冲突
