建立新型冠状病毒分离和培养方法，为抗新型冠状病毒药物研发和动物实验打下理论基础并提供实验依据，同时探究病毒TCID50与基因拷贝数之间可能存在的数量关系。
采集本省一例新型冠状病毒感染的肺炎患者的咽拭子标本，将处理后的标本接种于Vero细胞并进行病毒分离，通过qPCR和二代测序鉴定该分离毒株，同时测定该毒株的半数组织细胞感染量（50% tissue culture infection dose，TCID50）。稀释质粒标准品并进行qPCR，建立标准品线性回归曲线，检测不同代次、不同TCID50的病毒基因拷贝数。
将标本接种于Vero细胞后，24~72 h未发现明显细胞病变效应（Cytopathogenic effect，CPE），96 h细胞出现明显CPE，可判定为+，120 h细胞全部发生病变。
新型冠状病毒可在Vero细胞系中增殖，并可连续传代；在限定病毒传代次数等条件下，病毒TCID50和病毒基因拷贝数之间存在对应的数量关系，可实现二者间的替换。
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2020年2月，国际病毒分类委员会将新型冠状病毒正式命名为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。截至2020年3月9日，全国已累计报告病例80 735例，累计死亡病例3 119例[1]。
SARS-CoV-2是具有包膜的单正链RNA病毒，其宿主范围目前并不十分明确。研究表明，SARS-CoV-2与蝙蝠体内分离的冠状病毒同源性较高，提示蝙蝠可能是其自然宿主，另有研究表明，冠状病毒的宿主范围改变可能与其基因序列的高频重组和突变有关[2,3]。目前，SARS-CoV-2的基因组学研究已经获得了很大进展，亚单位疫苗也正在研发中，但仍未找到针对SARS-CoV-2的有效药物，动物模型建立也尚无报道，相关基础研究仍处于起步阶段。这些基础研究中，病毒分离则是动物模型建立不可或缺的步骤，对抗病毒药物研发和减毒活疫苗研究及效果评价都至关重要。据此，本研究建立了利用Vero细胞分离SARS-CoV-2的方法，并比较了病毒TCID50和病毒基因拷备数之间的数量关系，为动物实验的开展及抗病毒药物筛选提供实验依据。
咽拭子标本取自本省一例新型冠状病毒感染的肺炎患者，-80 ℃冰箱保存；Vero细胞为本单位微生物检验室冻存；DMEM培养基（Dulbecco’ s Modified Eagle Medium）、胎牛血清（Fetal calf seru ，FBS）和0.05% EDTA-胰酶购自Invitrogen公司；一步法qPCR试剂购自Bioline公司；SARS-Cov-2荧光PCR检测试剂盒购自上海伯杰；SARS-CoV-2 N基因质粒、上下游引物和探针由上海生工生物有限公司构建合成（表1）。
qPCR引物和探针序列
qPCR引物和探针序列
| 引物（探针） | 序列(5’-3’) | 长度(bp) |
|---|---|---|
| 上游 | GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT | 22 |
| 下游 | CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG | 22 |
| Taqman探针 | TTGCTGCTGCTTGACAGATT | 20 |
将冻存于-80 ℃的咽拭子标本取出，4 ℃解冻后加入1倍体积的无菌PBS进行稀释，轻轻混匀后1 000 rpm离心5 min，取上清，用0.22 μm的针头过滤器对上清液进行过滤，并将过滤后的标本接种于单层Vero细胞，每瓶细胞接种标本0.5 mL，每份标本接种3瓶细胞，然后将细胞放入37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1.5 h，同时每隔15 min摇匀一次，弃上清液，加入含2%FBS的DMEM维持液5 mL，放入37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养，分别在Vero细胞接种咽拭子标本后的24 h、48 h、72 h、96 h和120 h观察CPE，同时设置正常细胞对照。
将分离到的病毒毒株放入56 ℃金属浴中，进行灭活处理，时长为30 min，然后将灭活后的病毒转运至BSL-2实验室，提取病毒核酸，同时进行qPCR检测和二代测序鉴定。
选择培养36 h生长旺盛、成层较好的Vero细胞一瓶，弃去生长液，加入0.05%EDTA-胰酶5 mL，37 ℃消化5~10 min，倾去消化液，加入含10%FBS的DMEM重悬细胞，使细胞悬液浓度为5×105/mL，将稀释好的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.2 mL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养18~24 h，待细胞长成单层后，弃去培养液，PBS洗2次。将待测病毒培养物用含2%FBS的DMEM作10倍递度稀释（表2），每孔加入不同浓度病毒稀释液0.1 mL，每个稀释度8个复孔，另设8个对照孔，37 ℃孵育1.5 h，然后每孔加入细胞维持液0.1 mL，逐日观察细胞CPE，连续观察4 d。
病毒稀释方法
病毒稀释方法
| 稀释倍数 | 10-1 | 10-2 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| SARS-Cov-2 (mL) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 维持液(mL) | 0.9 | 0.9 | 0.9 | 0.9 | 0.9 | 0.9 |
测定质粒浓度，根据质粒相对分子质量，计算其拷贝数。对抽提的质粒溶液进行递度稀释，以稀释后的质粒作为标准品，进行qPCR，每个稀释度做三个复反应。反应总体系为20 μL，其中2× No-Rox mix 10 μL，10 μM上下游引物各0.8 μL，10 μM探针0.2 μL，逆转录酶0.2 μL，RNA酶抑制剂0.4 μL，ddH2O 6.6 μL，质粒1 μL。反应程序分两步，第一步45 ℃ 10 min逆转录，95 ℃ 2 min聚合酶激活，一个循环；第二步95 ℃ 5 s变性，60 ℃ 32 s扩增，40个循环，60 ℃收集荧光。
根据所建立的新冠病毒分离培养方法，将原代病毒稀释至50 TCID50，接种于Vero细胞，96 h收获病毒培养物，同时进行qPCR检测和TCID50测定。以同样的病毒感染剂量对病毒蚝连续传代，通过标准曲线，计算出不同TCID50所对应的病毒基因拷贝数，建立病毒基因拷贝数与TCID50之间可能存在的对应关系。
利用GraphPad 5.0对实验数据进行分析处理。
标本接种于Vero细胞后24 h，接种组细胞无脱落，亦无明显细胞病变效应（Cytopathogenic effect，CPE）出现，对照组细胞已覆盖整个细胞培养瓶底，呈成纤维细胞型生长，状态良好。标本接种后72 h，接种组CPE仍不明显，只有极少部分Vero细胞形态发生变化，伸出的细胞突起出现回缩，但细胞折光性并无明显增强，亦没有观察到明显的细胞融合现象。标本接种细胞后96 h，接种组的细胞出现明显CPE，其典型特征是细胞表面出现多个局灶性病变，病变细胞出现大量脱落，显微镜下可观察到几十微米到几百微米大小不等的空斑，同时病变细胞折光性增强，部分细胞开始融合，形成合胞体，此时CPE可判定为+。标本接种120 h后，接种标本的Vero细胞已全部出现CPE，此时可判定为++++，对照组细胞覆盖整个瓶底，长成多层，形态正常，仅少部分细胞出现脱落（图1）。细胞活力测定结果显示，0~72 h接种组和对照组细胞活力无明显差异，96 h接种组细胞活力明显下降，与对照组差异存在统计学意义（P<0.01)（图2）。
注：1D、3D、4D和5D分别代表接种于Vero细胞后24 h、72 h、96 h和120 h，100×
A:接种组SARS-Cov-2在Vero细胞中不同时间段的CPE；B:对照组Vero细胞在不同时间段的CPE
qPCR结果显示120 h的病毒培养物中SARS-Cov-2为阳性，Ct值为13.2。采用二代测序技术对该毒株进行高通量测序，对测序结果进行比对分析后发现，该毒株与BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019株的N基因同源性为100%，全基因组同源性为99.97%。经qPCR和测序分析对比，证实本实验室已成功分离到一株SARS-CoV-2，该毒株被命名为AH-sz005。
从新型冠状病毒感染的肺炎患者的咽拭标本中分离出来的病毒，梯度稀释后接种长满96孔板的Vero细胞，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50，结果显示该原代分离株的TCID50为10-3.5/0.1 mL。
本研究中所抽提的质粒物质的量浓度为1.3×10-12 mol/μL，根据相对分子质量，计算出质粒拷贝数为7.8×1010/μL，用ddH2O将质粒稀释至107拷贝/μL，然后再做10倍递度稀释，设制6个浓度递度，以Ct值为Y轴，拷贝数对数为X轴，建立y = -3.3517x + 39.049，R2=0.999的标准曲线（图3、图4）。
注：从左至右，N基因质粒被分别稀释至107拷贝/μl~102拷贝/μL
A：TCID50与拷贝数对应关系；B：标准品线性回归曲线
将病毒在Vero细胞中连续传5代，不同代次病毒接种细胞96 h后均能观察到明显CPE，qPCR检测病毒培养物的Ct值均在8~14之间（表4）。通过GraphPad软件计算，初步确立了SARS-CoV-2基因拷贝数与TCID50之间的对应关系，以LogTCID50为X轴，Y轴为拷贝数对数，建立了二者的对应关系为y = -1.131x + 3.6499，R2=0.975（图4）。
病毒传代信息
病毒传代信息
| 标本信息 | 毒株信息 | |||
|---|---|---|---|---|
| 标本类型 | Ct值 | 传代次数 | 培养时间（h） | 拷贝（/μL） |
| 咽拭子 | 14 | - | - | - |
| - | - | 1 | 120 h | 5×107 |
| - | - | 2 | 96 h | 3.7×107 |
| - | - | 3 | 96 h | 3.8×107 |
| - | - | 4 | 96 h | 2.2×109 |
| 5 | 96 h | 1.5×108 | ||
冠状病毒包含α、β、γ和δ四个属，其中SARS-CoV-2和SARS-CoV同属于冠状病毒科β冠状病毒属。国内外相关研究表明，Vero、Vero E6和LLC-MK2等均属于SARS-CoV的敏感细胞系，且SARS-CoV在Vero和Vero E6中培养，72 h左右便可出现明显的CPE[4]。本研究发现，SARS-CoV-2对Vero细胞同样敏感，但在Vero细胞中分离培养，需接种于Vero细胞72 h后才会出现明显CPE，且96 h后CPE进展很快，病毒的杀细胞效应突显，一般体外CPE的产生与体内感染产生的溶细胞作用相一致[5]，这也提示临床工作者在治疗一些前期症状较轻的患者时应提高警惕。
传统的测定病毒感染性强弱常用的方法为蚀斑形成实验和TCID50测定，蚀斑形成实验是将稀释的病毒感染敏感细胞，然后在细胞表面覆盖琼脂培养基，通过病毒感染灶形成的空斑来判断结果，尽管该法可将病毒感染性准确量化，但因其敏感性和重复性较差，从而限制了其应用[6]。TCID50测定尽管在一定程度上弥补了蚀斑形成实验在敏感性和重复性上的不足，但其结果判定主观性较强，CPE定义较模糊，特别是在针对一种全新的病原体时，进而可能影响实验结果的准确性。除此之外，在实验室使用半敞开式的96孔板进行TCID50测定，会增加病毒液溢洒的风险，提高实验室生物安全事故发生的概率。本研究对SARS-CoV-2的TCID50和基因拷贝数之间的对应关系进行了初步探讨，基本建立了二者之间的对应关系。在限制病毒传代次数、冻融次数、统一培养时间和保存温度的条件下，可在一定范围内实现病毒感染性强弱的准确定量，这将在很大程度上减少实验室感染事件发生的风险，为后期抗病毒药物筛选打下实践基础。
所有作者均声明不存在利益冲突
