探讨失血性休克对大鼠肺组织树突细胞聚集及肺损伤的影响，以及维生素C的保护作用。
SD大鼠(6～7周龄) 42只，按数字随机法随机分为对照组、失血性休克2 h、6 h、24 h组及失血性休克＋维生素C 2 h、6 h、24 h组等7组，每组各6只。以股动脉放血法建立大鼠失血性休克模型。免疫组化和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肺组织树突细胞特异性细胞间粘附分子非整合素蛋白-3(DC-SIGN)表达情况。同时检测肺TNF-α、IL-6含量，髓过氧化物酶(MPO)活性，并进行肺损伤评分。
对照组肺中DC-SIGN蛋白表达很少，失血性休克组表达显著升高(P<0.05)，失血性休克后2 h肺DC-SIGN mRNA含量就开始增高，休克后24 h仍呈升高趋势。失血性休克组大鼠肺TNF-α、IL-6 mRNA水平升高(P<0.05)，MPO活性增加(P<0.05)，病理损伤显著加重(P<0.05)。失血性休克大鼠在复苏前给予维生素C干预后，上述现象均减轻(P<0.05)。
失血性休克可能通过促进肺组织树突细胞聚集引起急性肺损伤。维生素C对这一过程有抑制作用。
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失血性休克(Hemorrhagic shock，HS)可引起全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)及多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)。ALI是休克重要的并发症及死亡原因[1]。ALI发病机制复杂，多种病理生理异常如肺泡上皮和血管内皮的损伤、中性粒细胞的呼吸爆发、凝血纤溶功能障碍等均参与其中，但根本原因在于失控的炎症反应。树突细胞(Dendritic cells, DCs)作为体内功能最强大的抗原递呈细胞，可启动并调节固有免疫及获得性免疫，因而在多种疾病的炎症反应启动过程中起重要作用[2,3]。过敏、病毒、细菌感染等可通过引起肺组织DCs聚集及活性增高而加重肺部炎症反应[4]。然而，在失血性休克引起急性肺损伤过程中肺组织DCs如何变化尚无研究。本文通过观察失血性休克及复苏后，大鼠肺脏内树突状细胞特异性细胞间黏附分子非整合素蛋白-3 ( DC-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN)表达量及肺部炎症损伤情况变化，探讨了肺DCs聚集在失血性休克导致ALI中的可能作用，以及维生素C(Vitamin C, Vit C)的保护作用。
6～7周龄雄性SD大鼠42只，体重250～300 g，购于上海BK实验动物有限公司，以数字随机法随机均分为7组：对照组、失血性休克2 h、6 h、24 h组和失血性休克＋维生素C 2 h、6 h、24 h组。每组6只大鼠。
参考Zhao等[5]在文献中描述的股动脉放血法建立大鼠失血性休克模型：以戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。无菌下行双侧股动脉插管，右侧经三通连接多导生理记录仪监测动脉血压，左侧连接注射器。经左侧股动脉缓慢抽血至平均动脉压降至35 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，继续抽血或者回输血液使大鼠平均动脉压维持在此水平60 min。然后以回输血液及等量的林格氏液的方法进行复苏，使大鼠平均动脉压在15 min内回升至基础水平。在复苏后不同时间点(2 h、6 h、24 h)处死大鼠并取材。
失血性休克＋维生素C 2 h、6 h、24 h组大鼠在复苏前腹腔注射维生素C(100 mg/kg)，失血性休克2 h、6 h、24 h组大鼠在复苏前腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。对照组进行麻醉及股动脉置管等操作但无股动脉放血及复苏过程。处死各组大鼠后，取动脉血、肺脏组织进行指标检测。
肺组织的病理变化、肺DC-SIGN表达情况、肺组织髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)含量、组织中TNF-α、IL-6含量。
采用RT-PCR法测定肺组织DC-SIGN、TNF-α和IL-6 mRNA水平。冰上进行组织匀浆，Trizol法提取肺组织总RNA。检测总RNA浓度后，取2 μg总RNA配制逆转录体系，在PCR仪上进行逆转录反应，ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。目的基因引物序列见表1。
基因上游及下游引物序列
基因上游及下游引物序列
| 基因 | 引物序列(5'→3') |
|---|---|
| Rat DC-SIGN:上游GCAAGGAGTCTACATCGTACTG | 下游GCTAGGGCAGGAAGTTGAAA |
| Rat TNF-a:上游CCCAATCTGTGTCCTTCTAACT | 下游CACTACTTCAGCGTCTCGTGT |
| Rat IL-6:上游CAAAGCCAGAGTCATTCAAGC | 下游GGTCCTTAGCCACTCCTTCTGT |
| Rat GAPDH:上游GGGGCCAAAAGGGTCATCATCTC | 下游AGGGGCCATCCACAGTCTTC |
肺组织病理检测采用甲醛固定的大鼠肺组织标本，脱水后石蜡包埋。用切片机将组织块切成厚4～6 μm的切片，常规苏木精-伊红染色和免疫组化染色，光学显微镜下观察组织病理变化和DC-SIGN表达情况。肺损伤评分标准：采用Smith评分体系，依据肺水肿、肺泡及间质炎细胞浸润、肺泡及间质出血、肺不张和透明膜形成等5项指标分别进行严重程度评分，各分值对应的严重程度如下0分：无损伤；1分：病变范围小于整个视野面积的25%；2分：病变范围介于整个视野面积的25%～50%；3分：病变范围介于整个视野面积的51%～75%；4分：病变范围大于整个视野面积的75%，总肺损伤评分为上述各项之和。每个标本观察10个高倍镜视野(×400)，取其平均值。
肺组织MPO含量检测，取0.1 g肺组织，制成5%组织匀浆。取组织匀浆0.9 ml，加入0.1 ml显色试剂，60 ℃水浴10 min。显色反应后，紫外分光光度计测定460 nm处光密度(OD)值。通过公式计算MPO活性单位数值： JMPO＝(D测定管－D对照管)×11.3×m取样。
主要实验仪器和试剂包括Powerlab 15T数据采集系统(ADInstrument公司，澳大利亚)、Real-time PCR system (ABI公司，美国)、Axiovision光学显微镜(Carl Zeiss公司，德国)、Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)、TaKaRa逆转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)、兔抗大鼠DC-SIGN抗体(Bioss公司，中国)、羊抗兔HRP标记的二抗(Sigma公司，美国)。
用SPSS 19.0进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD方法。P<0.05为差异有统计学意义。
与对照组相比，失血性休克2 h、6 h、24 h组大鼠肺组织的DC-SIGN表达量明显增加(P<0.05)，DC-SIGN的mRNA在失血性休克24 h组达到对照组的7.8倍左右。
失血性休克＋维生素C 2 h、6 h、24 h组大鼠的DC-SIGN表达量虽较对照组增高，但与取材时间点相同的失血性休克组相比明显下降(P<0.05)(见封三，图1)。
注：Ⓐ：对照组；Ⓑ：失血性休克24 h组；Ⓒ：失血性休克＋维生素C 24 h组；Ⓓ：各组肺组织DC－SIGN mRNA表达水平。*与对照组相比，P<0.05，**取材时间点相同的失血性休克＋维生素C组与失血性休克组相比，P<0.05。
与对照组大鼠相比，失血性休克6 h、24 h组大鼠肺组织出现明显的病理损伤(P<0.05)，如肺泡结构破坏、塌陷及融合，肺泡及间质水肿、充血、出血和炎症细胞的浸润，肺透明膜形成等。病理评分显著升高。失血性休克＋维生素C 6 h、24 h组大鼠组织病理损伤评分虽较对照组增高，但与取材时间点相同的失血性休克组相比明显降低(P<0.05)(见封三，图2)。
注：Ⓐ：对照组；Ⓑ：失血性休克24 h组；Ⓒ：失血性休克＋维生素C 24 h组；Ⓓ：各组肺组织病理损伤评分。*与对照组相比，P<0.05；**取材时间点相同的失血性休克＋维生素C组与失血性休克组相比，P<0.05。
大量研究证实，炎症因子TNF-α和IL-6是失血性休克引起SIRS及MODS的主要因素，故我们进一步观察了失血性休克及维生素C干预对肺组织TNF-α和IL-6表达水平的影响。
与对照组相比，失血性休克6 h、24 h组大鼠肺的TNF-α和IL-6的mRNA水平均显著增高(P<0.05)，TNF-a mRNA在失血性休克24 h组达到对照组的20倍左右，IL-6mRNA在失血性休克24 h组达到对照组的22倍左右。失血性休克＋维生素C 6 h、24 h组大鼠肺组织中TNF-α和IL-6水平，与取材时间点相同的失血性休克组相比均明显下降(P<0.05)(见封三，图3)。
注：Ⓐ：肺组织TNF－α含量；Ⓑ：肺组织IL－6含量。*与对照组相比，P<0.05；**取材时间点相同的失血性休克＋维生素C组与失血性休克组相比，P<0.05。
MPO活性是反映中性粒细胞浸润程度的可靠指标。结果显示，失血性休克6 h、24 h组，肺组织MPO活性较对照组显著增高，差异有显著统计学意义(P<0.05)，提示中性粒细胞浸润数量增多；失血性休克＋维生素C 6 h、24 h组大鼠肺MPO活性与取材时间点相同的失血性休组相比均明显降低(P<0.05)(见封三，图4)。
注：*与对照组相比，P<0.05；**取材时间点相同的失血性休克＋维生素C组与失血性休克组相比，P<0.05。
失血性休克及复苏过程中极易诱发急性肺损伤，具体的发病机制尚不明确，但炎症反应失控是起病的根本原因。本研究显示，在失血性休克及复苏后，大鼠肺组织中树突细胞显著增多，同时肺组织炎症因子及髓过氧化物酶活性增加，组织损伤加重。而在复苏前给予维生素C干预后，失血性休克导致的肺组织DCs增多、肺损伤加重等现象被抑制。
树突细胞作为功能最为强大的专职抗原提呈细胞(Antigen presenting cells，APCs)，广泛分布于除脑以外的全身各脏器，主要作用是捕获、处理及提呈抗原，激活免疫反应、诱导T分化及参与免疫耐受等。DC-SIGN表达在树突细胞表面，起到调节DCs成熟、黏附及迁移，激活初始T细胞免疫应答、启动炎症反应的作用，是树突状细胞的标志[6,7]。肺是各种病原微生物、理化因素的入侵门户。正常情况下肺内DCs很少，占肺单个核细胞的0.5%～1.0%。在炎症状态下，外周血未成熟DCs及DCs前体细胞快速向肺部转移，捕获处理抗原并逐渐分化成熟，提成抗原、激活T淋巴细胞，启动免疫反应，从而在哮喘等多种肺部炎症性疾病的发生发展中起到关键作用[8,9]。
已有研究显示DCs参与了ALI早期炎症反应的启动和发展： Winter等[10]发现DCs的增加显著促进肺内IL-6、TNF-α等炎症因子的释放，进而增加小鼠肺损伤程度和病死率。董亮等[11]也发现脂多糖诱导的ALI早期即存在肺DCs数量和成熟程度的增加，并可能通过增强Thl型免疫反应及IL-6、TNF-α的分泌启动及加剧ALI早期肺部炎症反应。而抑制DCs在肺脏的聚集及功能活化，可以明显减轻肺炎链球菌溶血素引起的肺损伤[12]。本研究首次发现失血性休克及复苏后，大鼠肺脏DCs明显增多，同时IL-6、TNF-α含量显著增多，肺损伤加重，提示失血性休克可能也是通过促进肺组织DCs聚集、提高肺组织炎症因子IL-6和TNF-α含量，来促进ALI发生。中性粒细胞是炎症反应中最早被动员的细胞。在ALI早期，中性粒细胞和巨噬细胞等白细胞被致炎因子激活，产生非特异性炎症反应，产生大量炎症介质包括细胞因子、氧自由基、氮氧化物等，在发挥清除病原体功能的同时引起肺组织损伤。DCs可通过多种途径促进中性粒细胞的浸润。研究发现DCs可通过释放趋化因子等促进中性粒细胞向炎症部位聚集[13,14]。Dransfield等[15]发现DCs可延迟中性粒细胞的凋亡。本研究发现在失血性休克及复苏后，大鼠肺组织树突细胞明显增多，同时髓过氧化物酶活性显著增加，与既往研究发现的DCs促进中性粒细胞浸润的现象一致。
维生素C是一种临床应用广泛的非酶类抗氧化物质。静脉给予高剂量的维生素C在多种危重症的救治过程中显示了良好的器官保护作用[16,17]。Fisher等[18]、Zhao等[5]发现大剂量维生素C干预可以显著减轻脓毒症及失血性休克引起的急性肺损伤。目前认为维生素C的脏器保护作用在于有效降低体内炎性因子水平及DAN氧化损伤等，具体机制尚不明确。本实验发现大剂量维生素C干预显著减轻了失血性休克及复苏后肺组织的树突细胞聚集及肺组织IL-6、TNF-α含量，这可能是维生素C能够减轻失血性休克造成的急性肺损伤的原因之一。
