对杭州地区严重急性呼吸道感染(SARI)住院患儿人博卡病毒(HBoV)感染的流行病学特征及其遗传进化进行研究。
连续收集2011年1月至2014年12月浙江大学医学院附属儿童医院SARI住院患儿病例样本共1 388份，采用荧光定量PCR进行HBoV1～4及其他常见呼吸道病原体检测，采用普通PCR对HBoV1阳性样本进行VP1全基因扩增和测序，所得序列采用Clustal X和MEGA 6.0软件进行分析。采用χ2检验和Fisher确切概率法进行数据统计分析。
1 388份SARI住院患儿样本中，共检出HBoV阳性85份，阳性检出率为6.12%，其中83份(97.65%)阳性样本为HBoV1，2份(2.35%)阳性样本为HBoV2。男性和女性患儿HBoV阳性检出率分别为6.54%和5.35%(χ2＝0.780，P>0.05)。各年龄段HBoV阳性检出率比较，差异具有统计学意义(χ2＝47.446，P<0.01)。>6个月～1岁年龄段HBoV阳性检出率最高，为12.84%，>3岁年龄段检出率最低，仅1.64%，≤6个月和>1～3岁年龄段HBoV阳性检出率相当，为3.04%和3.33%。按季节划分，HBoV检出率最高的是夏季(14.97%)，其次是秋季(7.14%)，春季(3.19%)和冬季(1.97%)检出率较低(χ2＝58.807，P<0.01)。HBoV在2011至2014年各年的检出率分别为7.39%、7.31%、5.58%和4.72%(χ2＝3.447，P>0.05)。合并其他呼吸道病原体感染率为62.35%，主要病原体为人鼻病毒(33.96%)、副流感病毒(28.30%)和呼吸道合胞病毒(20.75%)等。HBoV感染阳性患儿中气促和喘鸣的比例均高于阴性患儿(χ2＝15.161和13.914，P值均<0.01)。VP1基因序列分析发现，44株与瑞典株ST2属于同一分支，另2株毒株HZ12-S32和HZ12-S199单独成一分支。
HBoV是杭州地区SARI住院患儿中的重要病原体，与其他呼吸道病原体有较高的合并感染。大部分毒株与瑞典株ST2属同一分支，HZ12-S32和HZ12-S199两株毒株进化关系较远，单独成一新的分支。
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急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection，ARTI)是儿童发病率最高的一种疾病，其中严重急性呼吸道感染(Severe acute respiratory infection，SARI)是导致儿童死亡的最常见原因之一。研究表明，儿童ARTI>90%是由病毒引起，常见病毒有呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、流感病毒(IV)、人鼻病毒(HRV)、人偏肺病毒(HMPV)、Saffold心病毒、副流感(PIV)1～4型及冠状病毒(HCoV)等。目前为止，临床上仍有部分ARTI患儿未找到明确的病原，给临床治疗带来一定的困难，且可能间接造成抗生素的不合理使用[1,2]。因此，逐步揭示这些未知病原具有十分重要的临床意义。随着科技的发展，不断有新的病毒被发现，人博卡病毒(Human bocavirus，HBoV)于2005年由瑞典科学家Allander等[3]从ARTI患儿鼻咽抽吸物中发现，被认为与儿童呼吸道感染有关。本研究对2011年1月至2014年12月连续收集的杭州地区SARI住院患儿标本进行了HBoV的检测，分析其流行病学特征，并对VP1基因进行遗传进化分析，为杭州地区HBoV的防控提供重要依据。
收集2011年1月至2014年12月浙江大学医学院附属儿童医院SARI住院患儿病例样本共1 388份，于入院24 h内采集气管吸取物。患儿在入院时或住院期间，只要症状符合SARI病例定义，都须纳入监测。SARI病例定义为，>5岁儿童：(1)急性起病；(2)腋下体温≥38℃；(3)咳嗽或咽痛；(4)气促(呼吸频率≥25次/min)或呼吸困难。≤5岁婴幼儿：(1)急性起病；(2)咳嗽或呼吸困难；(3)伴以下症状或体征之一，如气促(<2个月的婴儿，呼吸频率>60次/min；2～<12个月龄婴儿，呼吸频率>50次/min ；12个月～5岁患儿，呼吸频率>40次/min )、拒食或呛奶、严重呕吐、抽搐、嗜睡或昏迷及胸壁凹陷或平静时喘鸣。所采集标本均置于装有3 mL病毒保护液的采样管中，4℃保存，48 h内送杭州市疾病预防控制中心检测。如48 h内无法送达，则保存于－80℃，1周内送检。
使用QIAamp DNA Mini Kit提取病毒DNA，使用Rneasy Mini Kit提取病毒RNA，操作步骤严格按照说明书进行。
采用多重实时荧光定量PCR进行HBoV1～4检测和分型[4]，反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环。CT值≤37判定为(＋)，>37判定为(－)。引物探针由Takara公司合成。Taq酶为Takara公司的HS Ex-Taq。
采用荧光定量PCR方法扩增HBoV阳性样本来检测以下病原体： RSV、ADV、IV、HRV、HMPV、Saffold心病毒、PIV1～4型， HCoV(HKU1、OC43、229E、NL63)、支原体(MP)、衣原体( CP)、肺炎链球菌(SP)、金黄色葡萄球菌(SA)、军团菌(LEG)、流感嗜血杆菌(HIN)和肺炎克雷伯菌(KP)[5,6,7,8,9,10,11,12]。
对HBoV1阳性样本采用普通PCR进行VP1全基因扩增。参考GenBank中编号为NC_007455的HBoV核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0设计VP1基因扩增引物(表1)。引物由Takara合成，Taq酶使用Takara Ex Taq。VP1全基因序列采用2对引物扩增2个相互重叠的片段后进行拼接而成。2对引物扩增条件相同：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，30个循环；最终72℃延伸7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工测序。测序结果用DNAMAN 5.2.2进行拼接和组装。为了确保测序结果的准确性，每条序列都进行了2次平行的扩增和测序。
人博卡病毒1型VP1全基因序列扩增引物对
人博卡病毒1型VP1全基因序列扩增引物对
| 引物对 | 序列( 5′～3′) | 位置a | 产物(bp) |
|---|---|---|---|
| VP1-1F | TAATAAAATAGGATGGGATAA | 2 826～4 056 | 1 231 |
| 1R | CATCAAGATCTGCGAGTTCAT | ||
| VP1-2F | TGACACAACATACAACAATGACCT | 3 871～5 213 | 1 342 |
| 2R | TCGGCTAGGTTCGAGACGGT |
注：a参考序列为GenBank数据库中NC_007455
将测序所得序列用Clustal X进行比对，然后使用MEGA 6.0软件，采用Neighbor-joining方法，用Bootstrap程序进行1 000次重复计算来建立系统进化树。
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用χ2检验和Fisher确切概率法，P<0.05为差异具有统计学意义。
经多重荧光定量PCR检测，1 388份SARI样本中，男性患儿902例，女性患儿486例。共检出HBoV阳性85份，阳性检出率为6.12%，其中83份(97.65%)阳性样本为HBoV1，2份(2.35%)阳性样本为HBoV2。男性患儿HBoV阳性率为6.54%(59/902)，女性患儿HBoV阳性率为5.35%(26/486)，差异无统计学意义(χ2＝0.780，P>0.05)。研究样本中患儿最小年龄为1个月，最大年龄4岁，中位年龄为5个月。按照不同年龄段自身免疫力的不同及所处环境的差异，并结合本研究的病例分布特点，分为≤6个月、>6个月～1岁、>1～3岁和>3岁四个年龄段，各年龄段HBoV阳性检出率相比，差异具有统计学意义(χ2＝47.446，P<0.01)。其中>6个月～1岁年龄段HBoV阳性检出率最高，为12.84%；>3岁年龄段检出率最低，仅1.64%；≤6个月和>1～3岁年龄段HBoV阳性检出率相当，为3.04%和3.33%。按季节划分，HBoV检出率最高的是夏季(14.97%)，其次是秋季(7.14%)，春季(3.19%)和冬季(1.97%)检出率较低。四季检出率比较，差异具有统计学意义(χ2＝58.807，P<0.01)。HBoV在2011至2014年各年的检出率分别为7.39%、7.31%、5.58%和4.72%，各年相比，差异无统计学意义(χ2＝3.447，P>0.05)。2013和2014年HBoV的检出率有所降低。2011至2014年HBoV感染的月份分布情况基本一致，每年5月份开始检出率增高，7～8月为检出高峰，9月有所回落，10～11月有个小高峰，12月开始明显下降，12～4月检出率较低，见图1和表2。
杭州地区严重急性呼吸道感染住院患儿人博卡病毒流行病学特征[例(%)]
杭州地区严重急性呼吸道感染住院患儿人博卡病毒流行病学特征[例(%)]
| 相关指标 | 检测样本数(n＝1 388) | 检出率 | χ2值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 性别 | |||||
| 男性 | 902 | 59( 6.54) | 0.780 | >0.05 | |
| 女性 | 486 | 26( 5.35) | |||
| 年龄 | |||||
| ≤6个月 | 823 | 25( 3.04) | 47.446 | <0.01 | |
| >6个月～1岁 | 444 | 57(12.84) | |||
| >1～3岁 | 60 | 2( 3.33) | |||
| >3岁 | 61 | 1( 1.64) | |||
| 季节 | |||||
| 春季(3～ 5月) | 407 | 13( 3.19) | 58.807 | <0.01 | |
| 夏季(6～ 8月) | 294 | 44(14.97) | |||
| 秋季(9～11月) | 280 | 20( 7.14) | |||
| 冬季(12～2月) | 407 | 8( 1.97) | |||
85份HBoV阳性样本中合并其他病原体感染53份，合并感染率为62.35%。其中合并2种病原体感染33份，合并3种病原体感染14份，合并4种病原体感染2份，合并5种病原体感染3份，合并6种病原体感染1份(表3)。与HBoV合并感染最常见的病原体是HRV(33.96%，18/53)，其次是PIV(28.30%，15/53)、RSV(20.75%，11/53)、Saffold(18.87%，10/53)、MP(16.98%，9/53)、ADV(13.21%，7/53)、HMPV(8.33%，4/48)、CP(7.55%，4/53)、KP(3.77%，2/53)、SP(3.77%，2/53)和HCoV(3.77%，2/53)。
杭州地区严重急性呼吸道感染住院患儿人博卡病毒与其他呼吸道病原体合并感染分布
杭州地区严重急性呼吸道感染住院患儿人博卡病毒与其他呼吸道病原体合并感染分布
| 合并感染病原体 | 例数 |
|---|---|
| HRV | 10 |
| PIV | 8 |
| Saffold | 3 |
| HMPV | 2 |
| ADV | 2 |
| RSV | 2 |
| MP | 4 |
| HCoV | 1 |
| CP | 1 |
| RSV＋HRV | 1 |
| HRV＋Saffold | 2 |
| PIV＋ADV | 2 |
| PIV＋HRV | 2 |
| RSV＋PIV | 1 |
| ADV＋PIV | 1 |
| PIV＋Saffold | 1 |
| RSV＋HCoV | 1 |
| RSV＋Saffold | 1 |
| HMPV＋CP | 1 |
| Saffold＋KP | 1 |
| RSV＋Saffold＋HMPV | 1 |
| RSV＋HRV＋MP | 1 |
| RSV＋HRV＋Saffold＋CP | 1 |
| ADV＋KP＋SP＋MP | 1 |
| RSV＋HRV＋MP＋CP | 1 |
| ADV＋RSV＋MP＋CP＋SP | 1 |
注：HRV.人鼻病毒； PIV.副流感病毒；Saffold.心病毒；HMPV.人偏肺病毒；ADV.人腺病毒；RSV.呼吸道合胞病毒；HCoV.人冠状病毒；MP.支原体；CP.衣原体；KP.肺炎克雷伯菌；SP.肺炎链球菌
HBoV阳性病例的症状主要为咳嗽(96.47%，82/85)、气促(62.35%，53/85)、发热(44.71%，38/85)、喘鸣(41.18%，35/85)、肺部听诊异常(89.41%，76/85)和X线肺部异常(77.65%，66/85)等。HBoV检出阴性病例的症状主要是咳嗽(93.71%，1 221/1 303)、气促(40.83%，532/1 303)、发热(39.52%，515/1 303)、喘鸣(23.25%，303/1 303)、肺部听诊异常(79.05%，1 030/1 303)和X线肺部异常(72.83%，949/1 303)。其中HBoV感染阳性患儿气促和喘鸣的比例均高于阴性患儿，差异具有统计学意义(χ2＝15.161和13.914，P值均<0.01)。
选取HBoV阳性样本中浓度较高的样本进行VP1基因扩增，产物经测序后用DNAMAN进行拼接，得到长度为2 016 bp的VP1全基因序列。将这些序列与GenBank中来自瑞典、荷兰、美国、泰国、日本等国家和中国台湾、中国香港、北京、广州和福州等地区的参考序列进行比对并构建进化树。研究得到的46株毒株序列被分成了2个分支，其中44株属于分支1，与瑞典株ST2属于同一分支；另外2株毒株HZ12-S32和HZ12-S199单独成一新的分支4，与分支1进化关系较远，该分支的形成有待于进一步研究来阐明，系统进化树见图2。
注：为GenBank中获取的参考序列
研究表明，HBoV与儿童ARTI有关[13]。通过对2011年1月至2014年12月连续四年收集的SARI住院患儿气管吸取物进行检测，共检出85例HBoV阳性病例，阳性率为6.12%，与国内外大部分文献报道结果一致[13,14,15,16]。85份阳性病例样本中2份为HBoV2，其余均为HBoV1，提示在SARI中HBoV感染以HBoV1为主，偶尔可见HBoV2，但HBoV2的病毒载量非常低，可能是伴随感染，未检测到HBoV3和HBoV4。
HBoV虽然可以感染任何年龄段人群，但儿童是主要易感人群。本研究中，HBoV感染患儿最小年龄为1个月，最大年龄4岁。不同年龄段的HBoV感染率比较，差异具有统计学意义。其中>6个月～1岁年龄段HBoV阳性检出率最高，达到12.84%，而≤6个月年龄段检出率仅为3.04%，儿童中HBoV的感染以>6～12个月为主。国内外多项研究结果也与本研究相似。Chung等[17]报道了HBoV主要引起>5个月儿童感染；Weissbrich等[18]报道了HBoV感染的高发人群是6个月～3岁；张学红等[19]发现HBoV发病年龄以6个月～3岁为主；Wang等[20]报道了我国上海地区HBoV感染以<2岁为主。
目前，国内关于HBoV连续几年的流行病学监测的报道不多。Zhang等[21]报道了北京地区2004至2006年连续三年的冬季HBoV的感染情况，发现三年的检出率较稳定；严华杰等[22]报道了上海地区2006至2008年连续三年HBoV的总检出率为10.7%，但未分别报道年检出率及三年之间的差异。本研究对杭州地区2011至2014年连续四年的HBoV感染进行了监测，结果显示四年检出率较稳定。表明HBoV是杭州地区SARI中的稳定病原体，且近几年在杭州地区无大流行的出现。
呼吸道病毒感染一般都具有季节性，根据目前国内外报道来看，HBoV感染的季节性在世界各地并不一致。Allander等[3]报道了瑞典的HBoV检出主要在冬季； Bastien等[23]报道了加拿大的HBoV感染无明显季节性； Foulongne等[24]报道了法国的HBoV检出高峰主要在12月～次年6月；I等[25]报道了中国香港地区的HBoV感染高发于9月～次年2月；严华杰等[22]报道了上海地区秋冬季HBoV的检出率高于春夏季，其中秋季检出率最高。本研究显示杭州地区HBoV的感染具有明显的季节性，2011至2014年每年的流行高峰基本相似，检出率以夏季最高，秋季次之，春季和冬季最低，检出高峰在7～8月。
大量研究表明，HBoV的合并感染率较高。 Martin等[26]报道美国的HBoV合并感染率为72%；Fry等[27]报道泰国的HBoV合并感染率高达90%；赵扬[28]报道兰州地区的HBoV合并感染率为57.1%；Wang等[20]报道上海地区的HBoV合并感染率为51%。本研究显示杭州地区的HBoV合并感染率为62.35%，与HBoV合并感染最常见的病毒是HRV。HBoV的高合并感染率是否表明其不具有单独的致病性呢，目前还存在争议和不确定性。我们推测引起HBoV的高合并感染率有两种可能：(1)HBoV感染机体后会持续存在于体内，病毒水平较低时，不引起机体发病，当机体感染其他病毒时，才大量繁殖使机体发病；(2)HBoV可能是一种病毒依赖性疾病，只有在别的病毒感染机体使机体发生某种病理变化后才能感染机体。但是目前研究中也表明存在一定比例的HBoV单独感染，因此还需进一步的研究。
研究发现，HBoV感染可引起呼吸道感染，临床症状与其它呼吸道病毒引起的感染基本相似，主要症状为发热、鼻塞、流涕、咳嗽、喘息及呼吸困难等，一般病情较轻，也有个别病例出现急性呼吸衰竭等危及生命的症状[29,30]。本研究中，HBoV感染阳性病例中具有气促和喘鸣的患儿比例明显高于阴性病例，差异具有统计学意义，提示HBoV感染可能引起患儿气促和喘鸣。
将85份HBoV阳性样本进行VP1基因扩增，由于有些样本浓度较低而无法成功扩增，最终测序得到46条HBoV1的VP1全基因序列。经过比对发现，杭州地区的HBoV1毒株大部分属于ST2基因簇，同时发现了2012年的两株HBoV1毒株HZ12-S32和HZ12-S199形成了一个新的基因簇，暂时将该基因簇命名为分支4，与分支1进化关系较远。HZ12-S32和HZ12-S199两株病毒株是否是由重组引起，导致了分支4的形成，有待于进行全基因组测序后进一步分析阐明。
HBoV是杭州地区SARI中的重要病原体，通过对其进行连续四年的监测和对其流行病学特征及遗传学分析，为杭州地区HBoV的防治提供了重要资料。
利益冲突 无
