脐血富含各类免疫活性细胞及其前体细胞，后二者可以被扩增和诱导分化为功能成熟的效应细胞。这些效应细胞主要包括树突状细胞(DC)、细胞毒性T细胞(CTL)、自然杀伤(NK)细胞、间充质干细胞(MSC)及调节性T细胞(Treg),并且在临床预防和治疗病毒感染、清除微小残留病(MRD)、抑制免疫排斥反应、治疗自身免疫性疾病等方面，发挥十分重要的作用。因此，脐血免疫细胞是细胞免疫治疗的极好来源。笔者拟就上述脐血免疫细胞及其临床应用的研究进展进行综述。
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脐血除因富含造血干细胞而被广泛应用于脐血移植，治疗各类血液系统疾病外，还含有大量的免疫活性细胞及其前体细胞，后二者可以被扩增为非特异性或抗原特异性的效应细胞。这些效应细胞被认为是近年细胞免疫治疗中最具开发潜力的细胞资源，可以解决临床适应性细胞治疗中效应细胞来源不足的问题。其中，脐血树突状细胞(dendritic cell，DC)具有强大的抗原递呈能力，可以刺激初始型T细胞产生病毒或肿瘤特异性细胞毒性T细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)；脐血自然杀伤(natural killer，NK)细胞亦可以产生病毒或肿瘤特异性CTL；而脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)和调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)具有免疫抑制功能，在预防和治疗造血干细胞或器官移植后免疫排斥反应、自身免疫性疾病等方面发挥独特的免疫调节作用。笔者拟就上述脐血免疫细胞及其临床应用的研究进展进行综述如下。
DC是目前已知功能最强的抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，其负载抗原刺激初始型T细胞产生特异性免疫应答并产生免疫记忆。脐血亦富含DC及其前体细胞，后者可以被扩增及诱导成熟。与外周血DC相比，脐血DC抗原递呈能力更强，因而刺激产生的CTL的细胞毒活性更强[1]。而脐血中的T细胞主要为初始型T细胞，其可被扩增、诱导及分化为特异性的抗病毒或肿瘤CTL，亦可以通过基因编辑技术转化为嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞。目前，基于这2类细胞的临床实际应用价值较大。
虽然脐血本身的DC数量有限，但是脐血中的CD34＋造血干细胞不仅可以扩增、诱导产生大量的DC，亦可以通过外源性Notch和四聚体T细胞受体(T-cell receptor，TCR)信号，扩增产生抗原特异性CD8＋ T细胞。DC可以直接用于实体瘤的辅助治疗。Mu等[2]将28例进展性胃癌患者分为研究组(接受脐血来源的DC和细胞因子诱导的杀伤细胞联合化疗治疗，n＝13)和对照组(仅接受化疗治疗，n＝15)，该研究结果显示，研究组患者的无病生存(disease free survival，DFS)期较对照组延长(P＝0.044 8)，细胞免疫功能较治疗前增加(P<0.05)，并且未发生严重的不良反应。为了更好地发挥DC的抗原递呈功能，通常将DC负载各类病毒、肿瘤特异性抗原或RNA后，刺激脐血初始型T细胞，扩增产生各类抗原特异性CTL，用于预防和治疗相关病毒感染性疾病及肿瘤[3]。
患者接受非亲缘脐血造血干细胞移植(unrelated cord blood transplantation，UCBT)后，造血及免疫功能重建较慢，机会感染较为常见，因此预防和治疗病毒感染，防止白血病复发尤其重要。但是高危或肿瘤负荷高的白血病患者接受UCBT后，由于缺乏供者细胞进行淋巴细胞输注以诱导更强的移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)效应，并且移植的脐血造血干细胞数量有限，因此该类患者复发风险高。采用特异性CTL免疫治疗可以提高该类患者生存率，但是UCBT后供者细胞缺乏仍然是亟待解决的问题。目前，特异性CTL免疫治疗手段包括：预留少量供者脐血，用以扩增特异性CTL；采用人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)部分或全相合的第三方脐血，用于扩增特异性CTL，建立各类病毒特异性的CTL库，为UCBT患者的临床免疫治疗提供有力支持[4,5]。有研究结果证实，脐血T细胞的抗肿瘤活性较成年人外周血T细胞强，前者的抗肿瘤活性属于同种异基因反应性，而非肿瘤特异性CTL引起；并且通过分析肿瘤浸润性淋巴细胞发现，脐血CC趋化因子受体(CC chemokine receptor，CCR)7＋ CD8＋ T细胞通过快速浸润至肿瘤细胞，在肿瘤局部微环境处诱导产生CD8＋、CD4＋辅助性T细胞(helper T cell，Th)1，而相比之下，外周血T细胞浸润速度慢，倾向于向抑制性Th2及Treg分化[6]。
研究发现，脐血PR1特异性CTL含量较外周血高，并且表达效应型记忆性T细胞标志物，由于PR1是HLA-A2限制性白血病相关抗原，在髓细胞白血病细胞上过表达，因此采用PR1多肽脉冲的APC刺激并成功扩增的DC，可以裂解表达PR1的白血病细胞[7]。该结果提示，脐血PR1特异性CTL在预防和治疗髓细胞白血病方面，具有非常广阔的应用前景。对于淋巴细胞白血病患者而言，输注白细胞特异性抗原靶向的CAR-T细胞可以清除患者体内的微小残留病(minimal residue disease，MRD)。但是由于淋巴细胞白血病患者的T细胞受损，其体外扩增效率较健康个体的T细胞低，难以获得足量的T细胞用于构建CAR-T，满足临床免疫治疗的需要。Pegram等[8]采用外源性细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-12和-15与脐血T细胞共培养的方法，使脐血T细胞扩增达150倍，并且表达特异性的中枢记忆/效应性表型。此外，该研究通过基因编辑技术，使脐血T细胞表达CD19特异性CAR和1928z，并且分泌IL-12[8]。由此推测，UCBT患者可以通过输注此类脐血CAR-T细胞，增加GVL效应，并且接受UCBT治疗的淋巴细胞白血病患者亦可通过该方法延长DFS期。
NK细胞是先天性免疫系统中最重要的细胞，能杀灭肿瘤细胞和病毒感染的细胞。患者接受造血干细胞移植(hematopoietic stem cells transplantation，HSCT)后，其体内NK细胞最先重建，并且发挥抗感染和GVL作用。异基因反应性NK细胞通过清除宿主残留的APC和供者异基因反应性T细胞，促进造血干细胞植入且不引起移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)，NK细胞还可以通过增加造血干细胞克隆形成促进造血干细胞植入[9]。
脐血富含NK细胞及其祖细胞，与外周血NK细胞相比，虽然脐血NK细胞高表达抑制性受体NKG2A，缺乏终末分化表型CD57，低表达活化性受体NKp46、NKG2C、DNAM-1，细胞毒活性低，但是脐血NK细胞高表达CXC趋化因子受体(CXC chemokine receptor，CXCR)4，这有助于其骨髓归巢。此外，无论是新鲜还是冷冻保存的脐血，其纯化的CD34＋造血干细胞均可以被诱导、扩增，产生功能成熟的NK细胞[10]。亦有研究结果证实，采用IL-12替代常规的IL-2刺激脐血造血干细胞，诱导产生的NK细胞功能更为成熟，细胞表达更高水平的NKG2A和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin receptor，KIR)，对靶细胞的刺激更为敏感，产生的γ干扰素及细胞毒活性更强，在体内抗白血病作用亦更强[11]。Liu等[12]研究发现，通过遗传学重编程技术构建的K562细胞刺激、活化脐血NK细胞，或者直接通过遗传学方法编辑脐血NK细胞的特异性基因，如CAR-CD19、IL-15、iC9(inducible caspase-9-based suicide gene)，可以改变NK细胞的抗原非特异性杀伤模式，使这类NK细胞获得长期且持久的特异性杀伤靶细胞的能力，从而显著提高其抗白血病能力。因为冷冻保存对脐血诱导分化的NK细胞的功能无影响，所以通过选择扩增及冷冻保存的脐血NK细胞，更适用于临床细胞免疫治疗的应用推广[13]。
目前，临床已经开展采用脐血造血干细胞扩增的NK细胞，治疗白血病或者实体瘤的临床试验。Dolstra等[14]采用部分HLA相合脐血CD34＋造血干细胞扩增的NK细胞治疗10例急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)老年患者，患者于接受化疗后，输注剂量为(3～30)×106/kg的NK细胞。该研究结果显示，10例AML老年患者均获得细胞形态学完全缓解，其中2例患者骨髓中MRD由治疗前的阳性转为阴性，并且持续时间长达6个月，所有患者均未发生治疗相关不良反应和GVHD[14]。亦有研究结果证实，脐血NK细胞可以清除多发性骨髓瘤(multimyeloma，MM)患者自体HSCT前体内的MRD，并且该脐血NK细胞具有NKG2D＋/NKp30＋活化表型[15]。
MSC广泛存在于骨髓、脂肪、子宫内膜、脐带组织及脐血中，在体外及体内特殊的微环境中，可以被诱导分化为肌肉、脂肪、骨和软骨、神经、尿路上皮、肝等组织的组织细胞，从而改善局部微环境、修复损伤组织。此外，MSC高表达IL-17受体，并且分泌负向免疫调控因子IL-10，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β，MSC在调控Treg及Th17细胞的增殖和分化过程中发挥重要作用。MSC分泌的外核体作为细胞间重要的信息传递分子，可以抑制CD4＋和CD8＋ T细胞的增殖，抑制γ干扰素，IL-6，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)α等炎性因子的分泌，具有抗炎和免疫抑制活性，并且保留了向T细胞递呈抗原的特性，亦被认为是耐受性APC[16]。MSC表面CD73、CD90、CD105等抗原表达呈阳性，而造血干细胞表面标志物，如CD14、CD79a、CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR等表达呈阴性，MSC低表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ，不表达MHC-Ⅱ、CD80、CD86，因此其免疫源性低，不易引起异基因免疫排斥反应[17]。MSC的免疫调节作用在支持造血、预防和治疗免疫排斥反应、治疗自身免疫性疾病方面应用广泛[18]。但是由于骨髓、脂肪、脾等不同来源的MSC的增殖能力、表型及功能特性有所不同，不同的培养条件亦严重影响MSC的生物学特性。并且，由于患者基础疾病的影响，自体MSC的功能存在缺陷，无法满足临床治疗要求达到的MSC数量。因此，第三方MSC是理想的供者细胞来源。脐血含有丰富的MSC，其制备简单、细胞生物学特性较为稳定、质量易于标准化，并且增殖能力强，细胞功能无明显差异。体内外实验均已证实，脐血MSC具有抑制分裂原诱导T细胞增殖，下调γ干扰素水平，上调IL-4水平，抑制GVHD的作用，因此脐血MSC成为目前MSC最理想的来源[19]。
脐血作为造血干细胞的重要来源之一，已经在临床得以广泛应用，但是由于脐血中造血干细胞数量有限，其在体重较重成年患者的异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)中应用受限，因此提高造血干细胞植入率是扩展其临床应用的前提之一。动物及临床试验均证实，脐血MSC能促进造血干细胞的植入，缩短中性粒细胞和血小板植入的时间，这可能与MSC改善骨髓微环境有关[20]。但是最近Kallekleiv等[21]纳入9项临床研究共计309例allo-HSCT患者的Meta分析结果显示，脐血MSC对造血干细胞的植入和患者GVHD的发生情况无显著影响(P<0.05)[21]。上述研究的结果存在差异的原因，可能是由于各项研究中MSC的细胞来源、输入的时间及数量、预处理方案等均未统一标准。
GVHD是allo-HSCT后常见的并发症，在HLA半相合HSCT患者中更为常见，通常累及多脏器的损害，严重影响患者的生活质量，同时GVHD亦为患者非复发死亡的重要原因之一[22]。临床常规采用皮质醇激素治疗急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)，但是皮质醇激素可能抑制GVL效应，增加原发病复发的机会，并且约25%患者对激素治疗不敏感。Le Blanc等[23]采用第三方骨髓来源的MSC治疗55例allo-HSCT后激素耐药aGVHD患者的研究结果显示，55例患者接受平均剂量为1.4×106/kg的MSC输注(27例输注1次，22例输注2次，6例输注3～5次)，其中30例患者对MSC治疗完全反应，25例患者对治疗部分或者无反应，患者的MSC治疗反应率与供、受者HLA匹配程度无关；对MSC治疗完全反应者移植后1年移植相关死亡率较部分或者无反应者显著降低(37%比72%，P＝0.002)，2年的总体生存率显著增高(53%比16%，P＝0.018)，因此该作者认为输注MSC可以有效地治疗allo-HSCT后激素耐药的aGVHD患者。最近，Dotoli等[24]采用无关供者骨髓来源的MSC输注对激素无反应的46例3～4级aGVHD患者进行挽救治疗，患者接受MSC输注的累积剂量中位数为6.81×106/kg，输注次数中位数为3次。该研究结果显示，46例患者的MSC输注临床有效率达50%(23/46)。脐血MSC作为MSC最理想的来源，已经在临床被广泛应用于allo-HSCT后aGVHD和慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease，cGVHD)的预防及治疗[25]。Gao等[26]纳入124例cGVHD患者的研究结果显示，研究组(接受脐血MSC输注治疗，n＝62)cGVHD患者的2年cGVHD累积发生率为27.4%，显著低于对照组(未接受脐血MSC治疗，n＝62)的49.0%(P＝0.021)，并且对照组中有7例患者发生严重的肺部cGVHD，而研究组患者则无肺部cGVHD发生。该研究还发现，研究组患者接受MSC输注后，其体内记忆性B细胞、Treg数量及Th1/Th2比例增加，NK细胞数降低[26]。因为T、B细胞均参与cGVHD的病理发生过程，尽管MSC输注后并不影响患者的T细胞数量，由于Th2细胞数降低，导致Th1/Th2比例增加，这提示Th1/Th2比例增加为MSC抑制cGVHD的机制之一。患者接受MSC输注后外周血CD27＋记忆性B淋巴细胞比例和数量均明显增加，这提示MSC亦影响记忆性B细胞亚群[26]。由此推测，患者接受HLA半相合的allo-HSCT后，脐血MSC输注可以降低cGVHD发生的风险。
脐血MSC在多种自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)和类风湿性关节炎等疾病中，均显示出对各种免疫细胞具有免疫调节作用。一项多中心临床试验证实，活动性/难治性SLE患者静脉输注脐血MSC后，患者SLE活动指数，血清自身抗体、白蛋白和补体水平，肾功能均较治疗前明显改善，并且多次输注脐血MSC可提高疗效[27]。Wang等[28]将活动性红斑狼疮患者输注脐血MSC前的外周血单个核细胞与MSC混合培养，通过监测脐血MSC的增殖和凋亡、表面标志物、功能分子，以及信号通路发现，活动性红斑狼疮患者的外周血单个核细胞可促进脐血MSC的增殖，刺激脐血MSC分泌血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和CXC趋化因子配体(CXC chemokine ligand，CXCL)-12，激活脐血MSC的AKT、IκB、STAT5信号通路，但是不影响其ERK1/2和SMAD1/5/8信号通路，而活动性红斑狼疮患者输注脐血MSC后的临床结果则显示，患者外周血中γ干扰素水平增加，这提示患者对脐血MSC治疗有反应。因此，临床考虑进行MSC治疗方案时，应针对性地选择合适的患者及MSC来源，从而提高MSC的临床疗效。此外，脐血MSC治疗对自身免疫性疾病引起的肝硬化患者亦有显著疗效。研究结果显示，26例因自身免疫性疾病引起的肝硬化患者接受脐血MSC输注后，分别于随访6个月、1年和2年时，患者的丙氨酸氨基转氨酶水平均较治疗前降低，血清白蛋白水平增加，凝血酶原时间缩短，终末期肝病模型积分明显改善，并且所有患者接受MSC输注后，无严重不良反应[29]。
Treg表达CD4＋ CD25high CD127low Foxp3high，其增殖及存活依赖于其他类型T细胞分泌的IL-2，Treg可以通过直接释放细胞因子，如TGF-β、IL-10、IL-35，或者间接抑制APC的方式，抑制CD4＋细胞、CD8＋细胞、NK细胞、DC的功能，在维持机体自身免疫耐受和免疫平衡中发挥关键作用。在实际临床应用中，Treg有降低HSCT后aGVHD的风险、抑制实体器官移植后移植物排斥、治疗自身免疫性疾病的作用。
虽然脐血中的大部分Treg为未成熟的前体细胞，其免疫抑制活性低于健康个体外周血Treg，但是脐血Treg体外扩增后的免疫抑制活性却明显高于外周血Treg。Fan等[30]通过比较体外扩增的外周血和脐血Treg发现，外周血和脐血Treg均高表达Foxp3、CD39和细胞毒性T淋巴细胞抗原(cytotoxic T-lymphocyte antigen，CTLA)-4，低表达CD127、IL-2、γ干扰素，脐血Treg维持GARP基因表达，并且其免疫抑制功能明显优于外周血Treg。该研究者进一步研究发现，外周血和脐血Treg均具有抗原特异性的抑制功能，并且接受外周血和脐血Treg输注的aGVHD模型小鼠的生存时间>63 d，较未输注Treg小鼠的生存时间(≤18 d)显著延长(P<0.05)[30]。由此可见，通过体外扩增脐血T细胞，获得大量同种异体抗原特异性Treg的方法是可行的，这对脐血Treg的临床应用意义重大。亦有研究发现，选择第三方脐血扩增的Treg经岩藻糖基化后，可以增加其骨髓归巢能力，从而提高其抗GVHD潜能[31]。采用抗CD3/CD28包被的磁珠联合IL-2刺激Treg扩增是经典的脐血Treg体外扩增方法。但是McKenna等[32]研究结果显示，采用表达高亲和力Fc受体CD64、CD86和CD28配体的K562细胞(KT64/86)作为APC，刺激脐血Treg扩增的效率较上述经典方法高，采用KT64/86刺激脐血Treg扩增2轮后，Treg的扩增倍数较采用经典方法高20～30倍，并且扩增获得的Treg表型及功能不受影响[32]。Seay等[33]研究结果显示，脐血Treg经过16 d的扩增，其细胞数扩增2 092倍，单份脐血能扩增得到1.26×109个Treg，通过体外扩增获得Treg完全可以满足临床治疗的需要。
目前，脐血Treg已经被应用于预防和治疗HSCT后aGVHD及自身免疫性疾病，其具有加速患者免疫功能重建，并且不增加感染、复发或早期死亡风险的优点。Brunstein等[34]研究结果显示，23例患者分别于接受双份脐血移植后1、15 d，接受脐血Treg输注，Treg剂量为(0.1～30.0)×105/kg，23例输注脐血Treg与103例未输注Treg的接受双份脐血移植患者相比，2～3级aGVHD的发生率有所降低(43%比61%，P＝0.05)，并且二者的感染发生率、复发率及早期病死率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Brunstein等[35]采用KT64/86作为APC刺激脐血Treg扩增，并将其以(3～100)×106/kg的剂量输注于11例接受双份脐血移植患者的研究结果显示，所有患者均未发生不良反应，与22例未接受Treg输注者相比，100 d内2～4级aGVHD发生率所有降低(9%比45%，P＝0.05)，1年的cGVHD发生率显著降低(0比14%，P<0.05)，但是二者之间的造血功能重建时间、供者细胞嵌合率、累积感染发生率、复发死亡率、非复发死亡率及无事件生存率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。
尽管脐血免疫细胞在临床已经得以广泛应用，并且疗效显著，但是在其应用过程中，应注意以下问题。首先，必须关注如何既能高效地对脐血免疫细胞进行体外扩增和诱导分化，又能保证脐血免疫细胞的生物学稳定；其次，尽管脐血免疫细胞的免疫源性低，但是并不能完全避免其被机体免疫系统识别及清除、在体内微环境中分化，所以脐血免疫细胞在体内存活时间有限，发挥作用时间亦受限制。此外，脐血免疫细胞用于辅助治疗疾病的适应证、治疗时机的选择、治疗剂量等，需要对其建立相应的治疗标准规范，以利于脐血免疫细胞治疗的临床疗效评估和进一步拓展其应用范围。
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