研究替莫唑胺（TMZ）联合放射治疗（放疗）诱导人脑胶质瘤U251细胞自噬及相关作用机制。
噻唑蓝实验检测不同浓度的TMZ（0~64 μmol/L）分别作用24、48 h后对U251细胞的增殖抑制作用；克隆形成实验检测不同浓度TMZ联合放疗下U251细胞的存活分数，评价TMZ的放射增敏作用；流式细胞术检测TMZ联合放疗对U251细胞凋亡的影响；蛋白质印迹法（Western Blot）检测微管相关蛋白1轻链3（LC3）-I、LC3-II、Beclin-1和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白的表达。
TMZ对U251细胞的增殖抑制作用具有浓度和时间依赖性，作用24 h和48 h的IC50值分别为42.25 μmol/L和25.13 μmol/L。TMZ对U251细胞具有放射增敏作用。TMZ联合放疗可诱导U251细胞凋亡，明显上调U251细胞中的LC3-II、LC3-I和Beclin-1蛋白表达，差异均具有统计学意义（均P<0.01），并下调p-Akt蛋白表达，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。
TMZ联合放疗能诱导U251细胞自噬，其作用机制可能是通过抑制Akt磷酸化来抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信号通路，促进自噬标志蛋白LC3-II、LC3-I和Beclin-1的表达，进而激活细胞自噬，发挥抗肿瘤作用。
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脑胶质瘤是一种原发性脑肿瘤，其恶性程度高，约占所有原发性神经系统肿瘤的30%，致死率在35岁以下肿瘤患者中居第2位。其中，多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM）占脑胶质瘤的一半以上，其恶性程度最高。目前，很多脑胶质瘤，包括大多数恶性种类对放射治疗（放疗）和化学药物治疗（化疗）均具有抵抗作用[1,2]。替莫唑胺（temozolomide, TMZ）是美国食品药品监督管理局批准的用于恶性脑胶质瘤的唯一口服化疗药物，其为第2代烷化剂化疗药，可直接作用于合成DNA的底物，使之甲基化从而引起DNA单链和双链断裂，抑制DNA复制，最终导致细胞死亡[3,4]。TMZ分子小，具有很好的亲脂性，能较好地通过血脑屏障，在中枢神经系统肿瘤治疗中具有良好的应用前景。近年来，欧洲癌症研究与治疗组织和加拿大国家癌症研究所联合开展的一项随机Ⅲ期临床试验（EORTC 26981-22981/NCIC CE.3）结果表明：TMZ联合放疗可显著改善GBM患者的预后[5]。而临床上针对GBM的靶向治疗药物（吉非替尼和埃罗替尼）的疗效均欠佳，这可能与联合治疗方案的合理性及耐药性等多种机制密切相关。本研究旨在重点研究TMZ联合放疗对人脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡和自噬的影响，并探讨其作用机制，为恶性脑胶质瘤联合治疗方案的制定提供理论依据。
人脑胶质瘤U251细胞（中国医学科学院基础医学研究所细胞中心），DMEM培养基、胎牛血清（美国HyClone公司），噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）[生工生物工程(上海)股份有限公司]，二甲亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）（美国Sigma公司），小鼠抗人微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3) -Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、磷酸化蛋白激酶B（phosphated protein kinase B, p-Akt）及β-肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体（美国Cell Signaling Technology公司），细胞培养板（日本Iwaki公司），TMZ（批号20180225）（江苏天士力帝益药业有限公司）。
Midi40 CO2培养箱（美国Thermo Electron公司），SW-CJ-1C超净工作台（苏州净化设备有限公司），CKX53倒置相差显微镜（日本Olympus公司），Model 680全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司），Varian 2300C X射线直线加速器（照射剂量率为2.51 Gy/min）（美国Varian公司），Gel-Pro Analyzer凝胶定量分析系统（美国Media Cybernetics公司）。
U251细胞采用含体积分数为10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM培养液，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。培养2~3 d后用质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化传代，选取对数生长期细胞进行实验。
取对数生长期U251细胞，消化、计数后调整细胞浓度为2×104个/ml，接种于96孔培养板中培养48 h；实验组分别加入不同浓度的TMZ（2、4、8、16、32、64 μmol/L），每个浓度设6个复孔，对照组加入等体积磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），分别培养24、48 h；加入MTT溶液（5 mg/ml），继续孵育4 h；吸去上清，加入DMSO（150 μl/孔），振荡10 min后采用全自动酶标仪检测各孔于492 nm处的吸光度（A）值，实验重复3次。按以下公式计算细胞抑制率，拟合后求出半数抑制浓度（IC50）值。
细胞抑制率（%）=（1-A实验组/A对照组）×100%
式中：A实验组和A对照组分别为实验和对照组于492 nm处的吸光度值。
将对数生长期U251细胞以2×104个/ml的浓度接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h；分为对照组和TMZ联合放疗组，对照组加入等体积PBS作用48 h后给予X射线照射，TMZ联合放疗组加入不同浓度TMZ（8、16、32 μmol/L）作用48 h后给予X射线照射，X射线照射剂量分别为0、1、2、4、8 Gy；照射后4 h更换无药培养基，于培养箱中继续培养12 d；甲醇固定后Giemsa染色15 min，统计各组≥50个细胞的克隆数。计算集落形成率（plating efficiency，PE）和细胞存活分数（surviving fraction，SF）。应用Sigmaplot 10.0软件按多靶单击模型拟合细胞存活曲线，计算放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）。
式中：SF2为X射线照射剂量为2 Gy时的细胞存活分数。
将对数生长期U251细胞以1×105个/ml的浓度接种于6孔板中，对照组加入等体积PBS作用48 h，放疗组培养48 h后给予X射线照射（6 Gy），TMZ组加入25 μmol/L（即IC50）TMZ作用48 h，TMZ联合放疗组加入25 μmol/L TMZ作用48 h后给予X射线照射（6 Gy）。细胞经胰酶消化、离心、PBS洗2次，加入5 μl异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V和10 μl碘化丙啶，避光染色15 min，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。
将对数生长期U251细胞按1.2.4节分组处理后，收集各组细胞，加入细胞裂解液，于冰上放置15 min；268× g离心15 min，取上清，采用Bradford法对蛋白定量后置于-80 ℃保存；蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离、转膜、封闭；分别加入一抗小鼠抗人LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt、β-肌动蛋白单克隆抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；加入二抗辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体（1∶5 000），室温孵育2 h；ECL显色，曝光显影，以β-肌动蛋白为内参，采用Gel-Pro Analyzer 3.0软件进行灰度值分析。
采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量数据以均值±标准差（
±s）表示，组间比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
采用MTT实验检测不同浓度的TMZ（0、2、4、8、16、32、64 μmol/L）分别作用24 h和48 h后对U251细胞的增殖抑制作用。结果显示，在相同作用时间下，细胞抑制率随着TMZ浓度的升高而升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；在相同TMZ浓度下，细胞抑制率随着作用时间的延长而升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。TMZ对U251细胞作用24 h和48 h的IC50值分别为42.25 μmol/L和25.13 μmol/L。上述结果表明，TMZ对U251细胞的增殖具有抑制作用，并呈时间和浓度依赖性。（图1）
U251细胞给药TMZ（8、16、32 μmol/L）后孵育48 h，再进行不同剂量的X射线照射，计数12 d后克隆形成率，并计算各组细胞存活分数，绘制细胞存活曲线。结果如图2所示，与对照组相比，TMZ浓度为8、16、32 μmol/L时的放射增敏比分别为1.52、1.58和2.06，表明TMZ可增加U251细胞对X射线的敏感性，具有一定的放射增敏作用。
流式细胞术检测结果如图3所示：对照组、放疗（6 Gy）组、TMZ（25 μmol/L）组和TMZ联合放疗组U251细胞的凋亡率分别为（0.23±0.02）%、（1.22±0.04）%、（4.94±0.06）%和（11.73±0.05）%；TMZ联合放疗组细胞凋亡率高于其他3组，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。该结果表明，TMZ组可诱导U251细胞凋亡，而TMZ联合放疗组诱导U251细胞凋亡的作用更为显著。
TMZ—替莫唑胺。TMZ浓度为25 μmol/L，X射线照射剂量为6 Gy。与TMZ联合放疗组比较，aP<0.05
Western Blot检测结果如图4所示：与对照组相比，TMZ联合放疗组的Beclin-1蛋白表达明显上调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，差异均具有统计学意义（均P<0.01），表明自噬体的数量明显增加；同时p-Akt蛋白表达明显下调，差异具有统计学意义（P<0.05）。上述结果表明，TMZ联合放疗能抑制Akt蛋白磷酸化，其可能通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）/Akt信号通路以及促进自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达，进而激活恶性脑胶质瘤细胞自噬。
TMZ—替莫唑胺；LC3—微管相关蛋白1轻链3；p-Akt—磷酸化蛋白激酶B。TMZ浓度为25 μmol/L，X射线照射剂量为6 Gy。与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01
细胞自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，参与多种疾病的发生和发展。自噬与凋亡之间存在着复杂的交互调控，二者能被多种应激刺激共同激活，共享多个调节分子，甚至互相协调转化等。研究结果发现，自噬调节涉及多种信号通路，其中以腺苷单磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK）及哺乳动物雷帕霉素受体(mammalian target of rapamycin, mTOR）信号通路为调控核心，AMPK促进自噬发生，而mTOR抑制自噬发生[6,7,8]。
自体吞噬表现为细胞生长过程中形成的能降解长寿命蛋白以及自体多余的或失去功能的细胞器的功能。研究结果发现，PI3K/Akt/mTOR信号通路在自体吞噬中发挥着关键的调节作用。针对GBM的癌症基因组图谱研究结果显示：ERBB2、NF1和TP53能诱发PI3K调控亚基编码基因PIK3R1的突变[9]。在超过50%的GBM中存在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）的过表达，而EGFR的过表达能激活EGFR III型突变体，进而引发侵袭性和耐药性[10]。本研究中MTT实验结果显示，不同浓度的TMZ对U251细胞的增殖抑制作用具有明显的浓度和时间依赖性。克隆形成实验结果显示，TMZ联合放疗组对U251细胞存活的抑制作用明显高于放疗组，且TMZ对U251细胞具有一定的放射增敏作用。流式细胞术检测结果表明，TMZ联合放疗能诱导U251细胞凋亡。
LC3是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。其中，LC3-Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直至与溶酶体融合，可作为自噬体的标记分子。LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与自噬体的数量呈正相关，在某种程度上反映了细胞的自噬活性[11,12]。本研究结果显示，TMZ联合放疗能明显上调LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表达，表明自噬体的数量明显增加；同时还能明显下调p-Akt蛋白表达，抑制Akt蛋白磷酸化。
综上所述，TMZ能明显抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖，且与放疗联合具有明显的增敏作用，TMZ联合放疗能诱导激活恶性脑胶质瘤细胞自噬。其作用机制可能是通过抑制Akt磷酸化来抑制PI3K/Akt信号通路，促进自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达，进而激活细胞自噬。但其确切的作用机制还需体内动物实验的进一步研究证实。
无
