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二十二碳六烯酸改善棕榈酸诱导的C2C12细胞胰岛素抵抗作用
中华医学杂志, 2015,95(3) : 226-230. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.03.017
摘要
目的

观察二十二碳六烯酸(DHA)对棕榈酸诱导的C2C12细胞胰岛素抵抗的影响。

方法

将C2C12细胞诱导分化成熟，加棕榈酸及DHA处理，通过实时聚合酶链反应(real-Time qPCR)及免疫印迹检测C2C12细胞葡萄糖转运体-4(GLUT4)、胰岛素受体-β(IR-β)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达；谷胱甘肽检测试剂盒检测超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，荧光分光光度计检测活性氧(ROS)；[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖检测C2C12细胞葡萄糖摄取量。

结果

棕榈酸组与对照组比较，磷酸化胰岛素受体底物-1(P-IRS-1)的表达上调[(2.9 ±0.3)比(1.1±0.1)，P<0.05]；磷酸化胰岛素受体-β(p-IRβ)表达下调[(0.87±0.09)比(1.58±0.21)，P<0.05]；GLUT4表达下调[(1.1 ±0.3)比(3.3±0.4)，P<0.05]；炎症分子MCP-1、IL-6、iNOS表达明显上升：[MCP-1：(27.2±0.6)比(1.0 ±0.1)，P<0.001；IL-6：(94.9±6.5)比(0.8±0.0)，P<0.001；iNOS：(288.0±15.6)比(1.8±0.6)，P<0.001]。C2C12细胞氧化应激标志物ROS升高2.1倍(P<0.05)，SOD 、GSH-Px活性分别下降63%及49%(P<0.05)；DHA组与棕榈酸组比较，p-IRS-1的表达下调[(1.3±0.2)比(2.9 ±0.3)，P<0.05]，p-IRβ表达上调[(1.3±0.2)比(0.9 ±0.1)，P<0.05]，GLUT4表达明显升高[(2.8±0.4)比(1. 1 ±0.3)，P<0.05]；炎症分子MCP-1、IL-6、iNOS表达均明显下调[MCP-1：(18.5 ±0.3)比(27.2 ±0.6)，P<0.001；IL-6：(1.7±0.4)比(94.9±6.5)，P<0.001；iNOS：(5.0±0.9)比(288.0±15.6)，P<0.001]，氧化应激标志物ROS下降55%(P<0.05)，SOD 、GSH-Px活性升高72%及64%(P<0.05)。

结论

DHA通过激活C2C12细胞的胰岛素信号通路，减少细胞的炎症反应及氧化应激而改善胰岛素抵抗。

引用本文: 喻日成, 罗建华, 于瑞萍. 二十二碳六烯酸改善棕榈酸诱导的C2C12细胞胰岛素抵抗作用 [J] . 中华医学杂志, 2015, 95(3) : 226-230. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.03.017.
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胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的一个重要环节。骨骼肌占体重的40%，体内80%的依赖胰岛素刺激的葡萄糖代谢由其完成。在肥胖患者中，肝脏及骨骼肌细胞脂肪酸的不充分氧化，过量的脂肪酸堆积通过乙酰辅酶A、甘油二酯、神经酰胺导致胰岛素抵抗[1]。体外研究表明，棕榈酸通过诱导氧化应激，线粒体DNA损伤，导致线粒体功能障碍、细胞凋亡，从而抑制骨骼肌细胞中胰岛素信号[2,3]。游离脂肪酸所致的骨骼肌细胞的低度炎症也参与了骨骼肌细胞的胰岛素抵抗[4]。二酰基甘油(DAG)介导的蛋白激酶C(PKC)激活和Toll样受体活化激活转录因子蛋白(NF-κB)，产生多种促炎因子，参与骨骼肌细胞的胰岛素抵抗[5]。PKC亚型还能磷酸化胰岛素受体底物-1(IRS-1)，导致胰岛素信号受损[6]。葡萄糖进入肌肉和脂肪组织依赖于特定的葡萄糖转运体(GLUT)，在骨骼肌中起主要作用的是GLUT4[7]。在严重胰岛素抵抗的2型糖尿病患者中GLUT4的表达明显下调[8]。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是一种不饱和脂肪酸，有抗炎及抗氧化作用，本研究探讨DHA对骨骼肌细胞胰岛素抵抗的作用。

材料与方法
一、材料
1．主要试剂：

C2C12细胞(ATCC); DMEM培养基、胎牛血清、马血清(Giboco公司)；RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)；逆转录试剂盒(Applied Biosystems); LightCycler® TaqMan® Master(Roche公司)；GLUT4、IRβ、p-IRβ、IRS-1、p- IRS-1、MCP-1、IL-6、iNOS、 β-actin抗体及HRP标记二抗(Santa Cruz公司)；[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖(Moravek Biochemicals公司)；二氯二乙酸酯(DCFDA，Invitrogen公司)；谷胱甘肽检测试剂盒(Sigma公司)。

2．C2C12细胞培养、分化：

C2C12细胞在含有10%胎牛血清、50 μ/ml青霉素、链霉素的DMEM培养液中37 ℃、5%CO2培养。细胞生长至融合期，换用含有2%的马血清的DMEM培养液，每天换液，4 d后倒置显微镜下可见肌管形成，说明C2C12分化成熟。

3．棕榈酸-牛血清蛋白(BSA)复合物溶液制备[9]：

将棕榈酸溶解于乙醇，按1∶100稀释于含有2%(w/v重量/体积)无脂肪酸牛血清白蛋白的DMEM中，–20 ℃保存备用。

4．分化成熟的C2C12细胞处理：

分化成熟的C2C12细胞换用含2%牛血清白蛋白的无血清DMEM培养基，分为3组：①对照组；②棕榈酸组；③棕榈酸＋DHA组。200 μmol/L的DHA预处理细胞24 h，再加入0.5 mmol/L棕榈酸作用24 h，在收集细胞前加入100 nmol/L的胰岛素，10 min后收集细胞，分别提取总RNA及总蛋白。

二、方法
1．实时聚合酶链反应(real-Time qPCR)检测基因表达：

(1)总RNA制备：RLT＋β-巯基乙醇裂解细胞，按QIAGEN试剂盒说明书介绍的方法提取总RNA，采用Nanodrop ND1000测量RNA的浓度。(2)cDNA合成：按逆转录试剂盒说明合成cDNA，每个反应体系含：1 μg RNA，2 μl 10×RT缓冲液，0.8 μl dNTP，2 μl随机引物，1 μl逆转录酶，总反应体系20 μl。反应条件：25 ℃，10 min；37 ℃，min；85 ℃，5 min；4 ℃；后取出样品，–20 ℃保存。(3)PCR扩增：PCR总反应体系为10 μl，含cDNA模板2 μl，TaqMan® Master 5 μl，ddH2O 2.5 μl，引物0.5 μl(表1)。PCR反应条件：95 ℃，10 min(1个循环), 95 ℃，5 s, 60 ℃，1 min，72 ℃，20 s (45个循环), 72 ℃，5 min(1个循环)。每个qPCR重复3次，以PPIA为管家基因，目的基因的相对表达量通过公式2–ΔΔCt计算。

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表1

实时聚合酶链反应引物

表1

实时聚合酶链反应引物

基因正义链反义链
PPIACAGGTCCTGGCATCTTGTCCATGCCCGCAAGTCAAAAGAA
IL6GTTGCCTTCTTGGGACTGATGCTGGCTTTGTCTTTCTTGTTATC
MCP-1TGAGCCATGGGAACAAGGAAGTCTTGTGCTGGTCTGTGATAGGCACAT
iNOSCTGCTGGTGGTGACAAGCACATTTATGTCATGAGCAAAGGCGCAGAAC
IRS-1GGCACATCTCCTACCATTCATCATCTCTGTATATTCCTCAAT
GLUT4TCTCAATGGTTGGGAAGGAAAGAACCGTCCAAGAATGAGTATCTC
2．免疫印迹检测蛋白的表达：

(1)收集处理的细胞，用冰磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，加入细胞裂解液，提取总蛋白，通过BCA方法测量蛋白浓度。(2)将30 μg的蛋白样品加入10%十二烷基酸钠-聚丙烯酰胶凝胶(SDS-PAGE)点样孔，100 V电压电泳2 h。(3)电泳完的凝胶转PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭，GLUT4、IRS-1、p-IRS-1、IRβ、p-IRβ、MCP-1、IL-6、iNOS及β-肌动蛋白(actin)一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加辣根过氧化物酶酶标记的二抗常温下30 min，TBST洗3次。(4)化学发光法显影、定影，将胶片进行扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

3．DHA对棕榈酸诱导的C2C12细胞氧化应激的影响：

分化成熟的C2C12细胞用200 μmol/L的DHA预处理细胞24 h，再加0.5 mmol/L棕榈酸作用24 h后换用无糖的DMEM培养基，加入二氯二乙酸酯(DCFDA)孵育20 min，刮下细胞转移到96孔板中，加Krebs-HEPES缓冲液中，荧光分光光度计检测ROS(激发光波长480 nm，发射光波长530 nm)。C2C12细胞SOD、GSH-Px检测采用谷胱甘肽检测试剂盒，按试剂说明书操作。

4．[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖摄取检测C2C12细胞对葡萄糖的摄取：

分化成熟的C2C12细胞用200 μmol/L的DHA预处理细胞24 h，再加0.5 mmol/L棕榈酸作用24 h后换用无糖的DMEM培养基，2 h后加入100 nmol/L的胰岛素孵育，20 min后加入[3H]-2DG作用5 min(7.6×104 Bq/ml加入1 μmol/L未标记的2-DG)，加入细胞松弛素B作用1 min，预冷0.9%氯化钠洗3次，0.5 mol/L氢氧化钠裂解细胞，加入同体积0.5 mol/L盐酸中和。BCA法测定蛋白含量，用液闪仪计数其每分钟衰变数(dpm值)。另设一组加10 μmol/L细胞松弛素B作为非特异摄取率，所有数据减去此值，作为各组细胞的葡萄糖摄取率，每次实验设3复孔，共重复3次实验，(C2C12细胞总放射活性-非特异性结合放射活性)/蛋白含量＝心肌细胞[3H]-2DG摄取量。

5．统计学处理：

所有数据用±s表示，分析采用SPSS 10.0软件，各组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，如果有统计学意义，两组间比较采用post hoc检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1．DHA降低棕榈酸诱导的C2C12细胞炎症因子表达：

通过检测炎症因子表达评价棕榈酸及DHA对C2C12细胞影响。0.5 mmol/L棕榈酸作用C2C12细胞24 h后，IL-6的mRNA表达明显升高[(94.9±6.5)比(0.8±0.0)，P<0.001]，蛋白表达水平亦升高。DHA预处理24 h后，IL-6的mRNA表达明显下降[(1.7±0.4)比(94.9±6.5)，P<0.001]，蛋白表达下降(图1A)；MCP-1于棕榈酸刺激24 h后mRNA表达明显升高[(27.2±0.6)比(1.0 ±0.1)，P<0.001]，蛋白表达水平升高；而加入DHA预处理组mRNA表达出现下降[(18.5 ±0.3)比(27.2±0.6)，P<0.001]，蛋白水平下降差异无统计学意义(图1B)；棕榈酸组iNOS mRNA表达较对照组明显上升[(288.0±15.6)比(1.8±0.6)，P<0.001]，蛋白水平亦升高；DHA预处理组iNOS mRNA表达明显降低[(5.0±0.9)比(288.0±15.6)，P<0.001]，蛋白水平亦明显下降(图1C)。

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图1
DHA降低棕榈酸诱导的C2C12细胞炎症因子表达。A.棕榈酸及DHA处理后IL-6 mRNA及蛋白水平变化；B.棕榈酸及DHA处理后MCP-1 mRNA及蛋白水平变化；C.棕榈酸及DHA作用后iNOS mRNA及蛋白水平变化。aP<0.05
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图1
DHA降低棕榈酸诱导的C2C12细胞炎症因子表达。A.棕榈酸及DHA处理后IL-6 mRNA及蛋白水平变化；B.棕榈酸及DHA处理后MCP-1 mRNA及蛋白水平变化；C.棕榈酸及DHA作用后iNOS mRNA及蛋白水平变化。aP<0.05
2．DHA增加C2C12细胞GLUT4、p-IR基因表达：

下调p-IRS-1表达：C2C12细胞分化成熟后用0.5 mmol/L棕榈酸处理24 h后，IRS-1 mRNA表达上调[(2.5±0.3)比(1.0±0.1)，P<0.05，图2A]；DHA预处理24 h组IRS-1 mRNA的表达无明显变化[(3.0±0.3)比(2.5±0.3)，P>0.05，图2A]，IRS-1总蛋白水平在棕榈酸及DHA处理后无变化，p-IRS-1蛋白水平在棕榈酸作用后明显升高，DHA作用后下降(P<0.05，图2A)。总IR蛋白水平在棕榈酸及DHA处理后无明显变化，但p-IR蛋白水平在棕榈酸作用后明显降低，DHA作用后其蛋白水平升高(P<0.05，图2B)；GLUT4在棕榈酸作用后蛋白水平明显下降，DHA预处理组蛋白水平明显增高(P<0.05，图2C)。

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图2
DHA对胰岛素信号通路基因表达的影响。A.棕榈酸及DHA处理后IRS-1基因表达变化；B.棕榈酸及DHA处理后IR基因表达的变化；C.棕榈酸及DHA处理后GLUT4基因表达变化。aP<0.05
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图2
DHA对胰岛素信号通路基因表达的影响。A.棕榈酸及DHA处理后IRS-1基因表达变化；B.棕榈酸及DHA处理后IR基因表达的变化；C.棕榈酸及DHA处理后GLUT4基因表达变化。aP<0.05
3．DHA减少棕榈酸诱导的C2C12细胞氧化应激反应：

分化成熟的C2C12细胞用0.5 mmol/L棕榈酸处理24 h后，活性氧(ROS)与对照组比较升高了2.1倍(P<0.05)；SOD及GSH-Px则出现明显下降(与对照组比较分别下降63%及49%，P<0.05)；而DHA预处理组ROS明显下降(与棕榈酸组比较下降55%，P<0.05)，SOD及GSH-Px与棕榈酸组比较分别升高72%及64%(P<0.05)。

4．DHA增加C2C12细胞胰岛素刺激下[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖摄取：

C2C12细胞用棕榈酸作用24 h后，与对照组比较葡萄糖的摄取减少[(0.8 ±0.1)比(1.2±0.1)，P<0.05]；DHA预处理24 h组葡萄糖的摄取较棕榈酸组升高[(1.3 ±0.1)比(0.8±0.1)，P<0.001]。

讨论

骨骼肌的胰岛素抵抗是2型糖尿病的一个主要特征[10]。肌肉对胰岛素敏感性降低的机制尚不清楚，但目前有研究表明慢性炎症及氧化应激与骨骼肌的胰岛素抵抗密切相关。骨骼肌摄取过多的游离脂肪酸，一方面通过NF-κB通路产生一系列炎症因子，另一方面通过增加细胞线粒体的活性氧而诱导氧化应激[11]，另外过多的游离脂肪酸通过PKC通路损害胰岛素的信号通路[12]，从而导致骨骼肌的胰岛素抵抗。DHA作为一种长链多不饱和脂肪酸主要通过生成脂类介质发挥抗炎和抗氧化作用，目前尚未见DHA对骨骼肌胰岛素抵抗的影响的相关报道。

我们用棕榈酸处理分化成熟的C2C12细胞发现：C2C12细胞分泌的炎症介质如IL-6、MCP-1、iNOS明显升高，而且增加了细胞的氧化应激反应，这与以往的研究结果相似[13]。为了阐明炎症及氧化应激对C2C12细胞胰岛素抵抗的影响，本研究检测了C2C12细胞葡萄糖的摄取及胰岛素信号通路，结果发现：棕榈酸作用C2C12细胞后葡萄糖的摄取明显减少，GLUT4表达明显下降，胰岛素信号通路中的p-IR表达明显下降，p-IRS-1表达明显上调。游离脂肪酸导致的骨骼肌细胞炎症使IRS的丝氨酸磷酸化，从而降低IRS-1与胰岛素受体的结合能力，GLUT4不能从细胞质转至细胞膜表面，影响骨骼肌细胞葡萄糖的摄取。另外促炎细胞因子还可通过降低胰岛素受体和GLUT4基因表达减少骨骼肌细胞胰岛素介导的葡萄糖摄取[14]。

DHA是一种22碳n-3多不饱和脂肪酸，主要来源于海洋生物，如鱼油及藻类。研究发现膳食高比率n-3/n-6多不饱和脂肪酸通过抑制活化TLR4改善SD大鼠肥胖相关的炎症和胰岛素抵抗[15]。但目前未见有关DHA对骨骼肌胰岛素抵抗的影响的相关报道。本研究用DHA作用于棕榈酸处理的C2C12细胞后发现：DHA能下调棕榈酸诱导C2C12细胞炎症分子IL-6、MCP-1、iNOS的表达及减少C2C12细胞的氧化应激反应。本研究进一步检测了DHA对C2C12细胞葡萄糖的摄取及胰岛素信号通路的影响，结果显示，DHA作用C2C12细胞后葡萄糖的摄取明显增加，GLUT4、p-IR表达明显上调。这些结果表明：DHA通过减少游离脂肪酸诱导的炎症反应及氧化应激影响胰岛素信号通路，增加葡萄糖的摄取，从而改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗。

本研究证实DHA减少棕榈酸诱导的C2C12细胞炎症因子及氧化应激，同时激活胰岛素信号通路，这可能与DHA减少C2C12细胞胰岛素抵抗有关。

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二十二碳六烯酸类
棕榈酸
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葡萄糖
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诱导型一氧化氮合酶
氧化应激
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