肺炎支原体感染的实验室检查对于诊断并开始抗感染治疗十分必要。肺炎支原体的实验室检测方法包括：培养、直接抗原检测、分子生物学检测(DNA和RNA检测)、血清学检测和其他一些新方法。本文就这些实验室检查的方法、优势、局限性和临床应用进行了总结。
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肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)属于支原体属支原体科支原体目柔膜体纲，是能够进行自我复制的、有能力在体外不依靠活体细胞而生存的最小微生物。MP肺炎约占儿童社区获得性肺炎的10%～40%[1,2]，导致10%的患儿入住ICU[3]。
MP感染的临床表现多样，从无症状到鼻咽炎、咽扁桃体炎、气管支气管炎、细支气管炎和肺炎，严重时可出现重症肺炎。MP感染不仅可出现呼吸道感染的表现，也可出现肝损伤、脑炎、急性肾小球肾炎、溶血性贫血等肺外多系统受累的表现[4]。确诊MP感染需要综合流行病学、临床资料和胸部影像学资料，并进行MP的实验室检查。但由于MP感染的临床症状轻重不一，且不典型，部分患者以肺外表现为首发症状，影像学检查缺乏特异性，MP感染常常被误诊、漏诊[5]。掌握MP的实验室检查方法对于及时诊断MP感染并开始抗感染治疗至关重要。本文就MP感染的各种实验室检查方法的操作、优点、局限性和临床应用情况进行阐述。
传统的MP培养法是将合格的呼吸道标本用液体培养基培养3～7 d，培养基变色后转入固体培养基，继续培养至镜下见到MP典型菌落或经基因、生化鉴定后判断为MP阳性[4]。MP培养要求高，需要复杂的培养基才能在体外进行分离培养。MP生长缓慢，需要多次传代培养才会出现阳性，培养时间至少为4～7 d，最佳培养时间需要21 d或更长。MP传统培养法特异性接近100%。MP培养阳性是判断MP感染的"金标准"，并能对分离株进行菌种鉴定、分型及药敏试验。但不能满足临床快速诊断的需要[1,4,5]。
目前有基于培养方法的快速检测试剂盒，其原理是MP利用试剂中的高营养和快速生长因子迅速增殖，产酸使得pH值降低，通过指示剂的颜色变化来判断MP的存在。其优点在于其阳性结果出现较早，6～90 h不等[5]。但缺点是容易被其他微生物(真菌等)污染，在标本采集、运输、培养过程中，使用的耗材和环境的酸碱度均能影响培养基的颜色而出现假阳性。另外，由于快速培养的阳性结果时间不符合生长传代时间，其特异性被很多学者质疑。即使快速培养阳性还应采用PCR或者血清学方法进一步确证，目前这种快速检测可用于基层医院的MP急性期感染的筛查，但不适合临床普遍推广[4,5]。
采用荧光、量子点、胶体金等标记的MP单克隆抗体，经抗原抗体反应后，在荧光显微镜下观察被特异性荧光标记的MP活跃性或肉眼观察颜色条来判断是否存在MP感染。目前多利用MP的黏附相关P1蛋白单克隆抗体和50S核糖体L7/L12核糖体蛋白特异性单克隆抗体[4,5]。MP抗原检测具有简单、快速的优点，适合于临床早期诊断。但局限性在于MP抗原检测的最小敏感度一般为1×106菌落形成单位(clonal formation unit，CFU)/L，而MP阳性患者的咽拭子标本病原体含量一般为1×105～1×106 CFU/L，不经过支原体扩增的抗原检测敏感度不高，容易出现假阴性。以50S核糖体的L7/L12核糖体蛋白组分为基础的直接抗原检测，与实时PCR对比，其敏感度仅为60%～70%[1]。虽研究表明利用MP的黏附相关P1蛋白单克隆抗体的特异度和敏感度分别为100%和97.4%[6]，但这也有待于更多的研究证实。另外一个局限性在于其结果的判读容易受到人为因素干扰[4]。随着核酸检测技术的不断发展，直接抗原检测技术逐渐被取代。目前日本仍在使用一些MP抗原检测技术，美国已经不再应用[1]，国内有零星的报道[6]。
包括DNA和RNA。具有敏感度高、特异度强、检测速度快的优点，适用于MP感染的早期[4,5]。虽然MP培养长期以来一直被认为是诊断MP感染的金标准，但核酸检测凭借着自身优势，逐渐被人推崇为新的"金标准"[1,7]。
MP-DNA检测技术众多，主要有荧光定量PCR和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)两种。荧光定量PCR主要根据MP的P1蛋白或16S rRNA靶基因设计扩增引物。除了检测快、不易污染、敏感度高和特异度强的优点外，还能定量检测，可用于MP感染的早期诊断[1]。但该方法操作技术要求高，仪器设备贵，样品采集、保存和处理要求高，不适合在基层医院中推广[8]。另外，基于PCR的检测不能区分MP引起的活动性感染与无症状携带[9]。由于MP和其他病原体感染的临床表现相似，设置了MP靶点的多重PCR已被认为是MP肺炎更实用的诊断方法[5,10]。LAMP是利用寡核苷酸引物和链置换DNA聚合酶在恒温下扩增靶DNA。当目标DNA被大量扩增时，可以被浊度或者荧光检测。整个检测过程15～60 min即可完成[11]。LAMP于2000年首次被发现，是一种相对较新的核酸扩增选择，可直接检测临床标本中的多种微生物，比PCR更简单、更便宜，适合没有设施或经验丰富人员的实验室。有研究表明，LAMP与MP的血清学检测、实时PCR相比，LAMP的敏感度总体较好[1,10]。在日本，LAMP被推荐为检测急性MP感染的一线诊断方法[12]。LAMP可检测样本为痰、鼻咽拭子、支气管肺泡灌洗液。对于下呼吸道感染的儿童，LAMP检测口咽拭子MP的敏感度和特异度优于鼻咽拭子[13]。MP-DNA检测的局限性是MP死亡后其DNA仍可存在于部分患者体内，时间可达7周～7个月，因此，MP-DNA不能用于疗效的评估。另外，设备、试剂及反应条件不理想，靶DNA提取效率低，均可能造成假阴性[4,5]。
MP-RNA检测是核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种核酸检测方法，简称为实时荧光恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing，SAT)。其优点在于直接以MP特异性RNA为扩增靶标，15～30 min即可将模板扩增109倍，扩增效率显著高于荧光定量PCR。且具有操作简单、快速、特异性强及敏感度高的特点。SAT属于活菌检测技术，MP死亡后RNA快速降解，在死亡的病原体中几乎检测不到RNA。因此MP-SAT阳性可提示MP的近期感染，而不是既往感染。有研究以血清学为MP感染诊断标准，显示MP-SAT的敏感度和特异度分别为83.6%和97.3%，提示其具有较好的诊断价值[14]。另有研究表明，MP-SAT在儿童支原体肺炎中可有效弥补血清MP抗体的窗口期，在早期诊断中的价值较高[15]。MP-RNA检测的局限性在于如果采集后的标本没有经过及时前处理，可能出现假阴性。综上，MP-RNA检测可作为MP感染早期快速诊断、评价MP感染转归及药物疗效的判定指标[4,5]。
MP感染机体后，正常免疫的机体开始出现特异性的抗体IgM、IgG和IgA。IgM抗体一般在感染后4～5 d出现，3～4周达到高峰，持续1～3个月甚至更长，是6个月以上儿童的近期MP感染的诊断指标。IgA与IgM变化基本一致，一般7～10 d达峰，回落比IgM和IgG早。IgG抗体出现较迟，一般于感染后14 d出现，峰值出现在感染后第5周，可持续较长时间，提示既往感染[4,5]。
临床上MP血清学检测常用方法有颗粒凝集法(particle agglutination，PA)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique，GICT)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay，IFA)等。下面逐一介绍各类血清学检测方法的特点。
原理是将MP细胞膜(可溶性抗原)致敏，或吸附在一定大小的颗粒状载体的表面，与人血清中存在的MP抗体结合后，在有电介质存在的适宜条件下可发生凝集。PA测定的是MP总抗体，是常用的诊断MP感染的血清抗体测定法。一般将血清抗体滴度≥1∶160作为MP近期感染或急性感染的参考标准。恢复期和急性期MP抗体滴度呈4倍及以上增高或减低时，可确诊MP感染。PA的优点是无需特殊检测设备，人工操作判读，有较好的可重复性，非特异性反应小。但缺点是，无法判断MP感染者血清中升高的抗体具体类型，也无法判断患者属于急性感染还是既往感染[4,5,9]。
通常以酶标记抗人免疫球蛋白抗体作为示踪物，可定性和定量的检测人血清中MP的IgM、IgG、IgA抗体。ELISA法对呼吸道MP感染的诊断具有重要参考价值。这是目前在MP血清学检测中使用最广、研究最深入的方法[1]。与传统的MP培养方法比较，此种方法优点在于耗时较短，仅需数小时，且与其他常见的呼吸道病原体无交叉反应。局限性在于需要间隔2～4周的两份血清样本，后者的抗体滴度应该是前者的4倍及4倍以上增加或减低，可确定为阳性，故不适合早期诊断。另外，ELISA不同试剂盒的特异度和敏感度差别较大[16]，据报道，一些重组蛋白作为ELISA检测试剂盒中预包被抗原敏感度和特异度均较高，适合开发[4,5]。
基本原理是反应板上的MP抗原可与待测样本中MP抗体结合，再与胶体金标记的抗人IgM抗体结合并显色，形成肉眼可见的红色斑点或条带判断阳性。国内有学者研究，在小儿MP检测中，对于高滴度MP IgM抗体，GICT符合率可达到临床诊断需求，且用血量少、方便、快捷、操作性强，有利于对儿科急性呼吸道感染的诊断，便于门诊和基层医院推广使用。但患者抗体含量较低时可能造成假阴性[4]。
从培养物中分离出菌落，脉冲激光照射样品，触发样品和基质的烧蚀和解吸，然后电离并加速进入质谱仪，产生独特的光谱，与生物库中的已知光谱进行比较。操作简便、鉴定迅速。这项技术分析的是整个细胞而不是核酸。可用于病原微生物的鉴定、细菌耐药性监测和某些特定菌株的分子流行病学分析[18]。作为一种新型的微生物鉴定技术，它在一些微需氧菌、厌氧菌及分支杆菌的鉴定上有传统生化反应或自动化鉴定仪器所无法比拟的优势，其可靠性和准确性已在国外许多研究中被证明[1,19]。在MP检测方面，一旦MP在培养基中培养，只要有昂贵的质谱仪可用，就可以低成本和高通量地快速鉴定和分型。深圳市人民医院检验科微生物实验室用此方法鉴定出人型支原体[1,20]。然而，进行MALDI-TOF MS的先决条件需要MP培养，MP培养耗时且敏感度低，限制了其对MP检测的有效性。MALDI-TOF MS对MP的检测仍有待于进一步的研究。
目前拉曼光谱技术已经成为一种鉴定微生物病种和亚种的新技术，可用于细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体的快速检测[21]。具有快速、高效、非接触、实时监测、无需培养及可重复性强的特点。有研究表明MP肺炎患儿与健康儿童血清拉曼光谱信号存在差异性，这就为这一技术应用于儿童MP检测奠定了相关研究基础[22]。SERS是指具有共振拉曼效应的分子吸附在粗糙化的银、金、铜等的表面，可明显增强信号，增加检测敏感度。Henderson等[23]开发了银纳米棒阵列-SERS生物传感器检测平台，是一种新的、独特的微生物病原体检测和分型技术，被认为是下一代支原体检测和菌株表征的方法。
mNGS是基于高通量测序技术以及生物信息学分析对病原体进行基因测序的临床实验诊断技术。随着基因组学技术的发展，mNGS越来越广泛地应用于感染性疾病的检测、分型和耐药评估等各个方面。其优点在于耗时短，检测范围广，采血少，敏感度高。局限性在于其无法鉴别细菌定植还是感染；缺乏针对不同标本的统一规范的检测流程；检测样本提取的核酸中人源序列背景太高，会干扰病原体检测等。受限于经济成本，mNGS短期可能无法成为临床一线病原体检测手段，但在疑难杂症、危重症、免疫缺陷等特殊人群中，是一种非常有效的广谱病原体筛查方法，具有较大的潜力[24,25]。
2019年中华医学会儿科学分会临床检验学组发布了"儿童肺炎支原体呼吸道感染实验室诊断中国专家共识"，将上述检测方法给出了分级推荐，一级推荐方法包括MP-RNA检测和PA测定MP抗体。二级推荐方法包括MP-DNA检测和ELISA测定MP抗体。三级推荐包括培养法、直接检测法、采用IFA、GICT的血清学检测方法及其他的非特异性血清学检测方法。一级为最佳方法，阳性可确诊MP感染，三级推荐方法中的MP直接检测法和GICT对门急诊患者MP感染诊断的快速初筛是有价值的，进一步诊断需一级、二级推荐方法的确认或动态复检[4]。
MP的实验室检测对于MP感染的合理诊治具有重要意义。不同的MP实验室检测方法具有不同的优势和局限性，临床医生要根据不同检测方法的特点，并结合患者临床症状、体征以及胸片等其他辅助检查，做出合理的选择。
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