新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是国际公共卫生的重大威胁，其在基因组学与SARS-CoV高度同源。针对SARS-CoV-2感染尚无针对性治疗方法，故了解病毒结构，阐明并利用它们的复制机制筛选治疗靶点是值得关注的课题。本综述主要围绕目前中和抗体的研发、主蛋白酶、聚合蛋白酶靶点研究、宿主细胞及病毒感染后期NF-kB和IL-6-STAT3通路中的关键分子作为治疗靶点加以综述，为药物及疫苗设计提供基础。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）属β冠状病毒属，核苷酸长度为29.9 kb，存在11个功能基因编码结构蛋白、非结构蛋白和辅助蛋白，结构蛋白包括刺突蛋白（spike proteins，S）、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。S蛋白是冠状病毒诱发中和抗体的主要抗原，是研究疫苗很好的靶点。非结构蛋白包括3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶[又称主蛋白酶（main protein，Mpro）]、木瓜蛋白酶样蛋白酶、解旋酶和RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）[1]，其中Mpro与RdRp为最具特征的药物靶标。SARS-CoV-2全基因组序列与严重急性呼综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）一致性约79.5%，且两种病毒均以血管紧张素转换酶II（angiotensin converting enzyme II，ACE2）为受体[2]。分析研究该病毒识别受体和感染宿主的分子基础，筛选开发靶向治疗药物是当务之急。本综述总结目前SARS-CoV-2相关药物靶点的研究结果，为将来研究提供基础。
S蛋白在功能上分S1亚基和S2亚基，S1亚基中的受体结构域（receptor binding domain，RBD）可与ACE2结合，且RBD是中和抗体的主要靶标。新冠肺炎恢复期患者血浆中含有适应性免疫反应产生的中和抗体，对新冠肺炎有一定疗效，但血浆来源有限且中和抗体滴度低，因此，研发易于生产与质控的单克隆中和抗体可能是治疗新冠肺炎的"特效药"。本文将目前SARS-CoV-2中和抗体的研究整理如下（表1）。
靶向SARS-CoV-2 S蛋白的中和抗体
靶向SARS-CoV-2 S蛋白的中和抗体
| 抗体来源 | 抗体名称 | 与SARS-CoV是否发生交叉反应 | 是否阻断受体结合 | 是否受D614G突变影响 |
|---|---|---|---|---|
| SARS恢复期患者 | CR3022 | 是 | 否 | 否 |
| S309 | 是 | 否 | 否 | |
| 新冠肺炎恢复期患者 | P2C-1F11、P2B-2F6 | 否 | 是 | 否 |
| BD-368-2 | NA | 是 | 否 | |
| B38、H4 | 否 | 是 | 否 | |
| 4A8 | NA | 否 | NA | |
| 全人源小鼠杂交瘤库 | 47D11 | 是 | 否 | NA |
| 人源化单域抗体噬菌体库 | N3130、n3088 | NA | 否 | NA |
| RBD免疫马血清 | Horse F (ab’) 2 | NA | NA | 否 |
注：NA为未见相关报道
由于SARS-CoV-2和SARS-CoV基因序列的高度同源性，评估抗SARS-CoV抗体与SARS-CoV-2 S蛋白之间的交叉反应，有利于SARS-CoV-2疫苗和治疗性抗体的快速研发。CR3022和S309均是从恢复期SARS患者中分离出来的靶向RBD的中和抗体，在RBD的结合位点与ACE2不重叠，即抗体对SARS-CoV-2的中和机制并不依赖于直接阻断RBD与ACE2结合[3,4]。Yuan等[5]发现CR3022的抗体结合位点隐藏在病毒内部且高度保守，提示我们尚有待发现的抗体可有效中和两种病毒。S309中和抗体识别RBD的24个氨基酸残基在所有已知的SARS-CoV-2突变株中均未发生突变，其中19个氨基酸残基与SARS-CoV相同，因此，S309有可能成为一种冠状病毒广谱的中和抗体[5]。
Ju等[6]从8例新冠肺炎恢复期患者的单个B细胞中分离并鉴定出206个特异性靶向RBD的单克隆抗体，其中中和活性最强的是P2C-1F11和P2B-2F6，2种抗体可分别将RBD与ACE2的结合降低约99.2%和98.5%。Wu等[7]分离出4种具有中和作用的人源单克隆抗体（B38、H4、B5和H2），均靶向SARS-CoV-2 RBD。其中B38和H4抗体识别RBD不同表位但均可完全阻止SARS-CoV-2 S蛋白RBD的受体ACE2结合，且B38和H4具有协同中和能力，表明2种抗体在临床上为较理想的病毒中和抗体，可避免免疫逃逸。另外，Cao等[8]通过高通量单细胞测序成功分离出的BD-368-2，在小鼠模型中显示BD-368-2除显著降低病毒载量外，还具有预防性保护作用，为SARS-CoV-2药物及疫苗设计提供了基础。
目前SARS-CoV-2中和抗体研究主要靶向S蛋白RBD，Chi等[9]对10名新冠肺炎恢复期患者的B细胞和浆细胞初筛发现4A8抗体靶向SARS-CoV-2 S蛋白NTD，该抗体具有较强的病毒中和能力。4A8与RBD靶向抗体联合治疗方法可有效避免病毒的逃逸突变。
Wang等[10]使用SARS-CoV、MERS-CoV 、HCoV-OC43的S蛋白免疫H2L2人源小鼠，发现产生的47D11可同时中和SARS-CoV-2和SARS-CoV，随后将嵌合47D11重组表达为完全人源IgG1同型抗体。该抗体并不能阻断RBD与ACE2结合，推测其可能与RBD的保守结构域结合，起到中和病毒的作用。Wu等[11]将全人源化的重链可变区抗体骨架进行筛选重构，并以SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白为抗原，筛选出靶向多类表位的纳米抗体，其中n3088和n3130抗体与CR3022相似靶向S蛋白特殊的隐藏表位，提示靶向该表位的全人源纳米抗体也可能具有较好的广谱性。此外，有研究以RBD为免疫抗原使用马等大型动物通过被动免疫产生的抗血清，使用胃蛋白酶消化、纯化、分离获得免疫球蛋白片段F（ab’）2，中和试验发现F（ab’）2对SARS-CoV-2具有抑制作用，且呈明显的剂量依赖关系，所以RBD特异性的F（ab’）2可作为SARS-CoV-2的候选治疗药物[12]。
SARS-CoV-2具有高突变性，研究发现使其传染性增加的D614G突变型病毒株可降低新冠肺炎康复期患者血清对病毒的敏感性，但该突变并不位于RBD区域，不太可能对正在研制的疫苗疗效产生重大影响[13]。除此之外，要进一步研究SARS-CoV-2中和抗体是否与SARS-CoV相似存在抗体依赖的病毒感染增强效应。
Mpro是一种半胱氨酸蛋白酶，参与病毒复制和转录，因此Mpro是一个抗病毒的关键药物靶点。为快速发现用于临床的先导化合物，Jin等[14]设计了该酶不可逆抑制剂N3，其可特异性抑制多种冠状病毒的Mpros，且研究团队对10 000多种临床药物以及天然活性产物进行筛选，发现了6种抑制Mpro的先导药物，该研究为迅速开发具有临床潜力的抗新冠肺炎的药物奠定了重要基础。另外，Zhang等[15]设计了拟肽α-酮酰胺，作为β和α冠状病毒以及肠病毒Mpro的广谱抑制剂，并不断优化其化学结构，开发成为SARS-CoV-2 Mpro的有效抑制剂。该研究为开发含吡啶酮的抗冠状病毒药物提供了有用的框架。
RdRp是病毒复制、转录的核心组成部分，可催化病毒RNA合成，是抗病毒抑制剂瑞德西韦的主要靶标。Cao等[16]率先解析了全长RdRp与辅助因子非结构蛋白7和8复合物的冷冻电镜结构，发现除核心保守结构域外，其N-末端存在一个独特的"β发夹"结构域，该结构域为阐明SARS-CoV-2 RdRp的生物学功能提供了新的线索。随后研究者解析了RdRp-RNA-瑞德西韦复合物的电镜结构，结构显示三磷酸瑞德西韦最终以单磷酸形式共价结合到RNA引物链3'端的+1位置，终止RNA引物链的延伸，从而阻止SARS-CoV-2遗传物质的复制。该发现揭示了瑞德西韦抑制SARS-CoV-2RdRp活性的机制，为靶向RdRp的新型药物筛选以及药物设计提供了基础[17]。
ACE2是病毒侵染细胞的受体，其在体外结构不稳定，B0AT1是一种中性氨基酸转运蛋白，可与ACE2形成稳定复合物。Yan等[18]在ACE2-B0AT1复合物三维结构中RBD结合位点附近存在3个糖基化位点，糖基化可使病毒逃过人体免疫细胞识别和攻击。最近，Wan等[19]报道SARS-CoV-2 RBD的493残基、501残基对应于SARS-CoV中的479残基、487残基，可分别被ACE2病毒结合热点Lys31、Lys353识别，如果病毒结合热点突变将影响其与受体ACE2结合，所以结合热点是重要的抗病毒靶点。Lei等[20]将人ACE2胞外区与IgG1的Fc区连接构建重组蛋白ACE2-Ig，对SARS-CoV-2和SARS-CoV具有显著中和作用，可作为阻断病毒入侵细胞的抑制剂。
研究发现乳铁蛋白通过与细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）结合抑制SARS-CoV入侵细胞，且不影响S蛋白与ACE2的相互作用。使用肝素酶或外源肝素可以阻止S蛋白与宿主细胞结合并抑制SARS假病毒感染。这表明除ACE2外，HSPGs是参与SARS-CoV入侵的重要细胞分子，使用治疗性抗体阻断细胞上的HSPGs有可能是治疗新冠的另一种策略[21]。
以上药物靶点仅在感染早期阻止病毒侵入细胞增殖，但细胞因子风暴引起的急性呼吸窘迫综合征出现在感染后期。研究发现病毒入侵细胞后识别细胞的模式识别受体，进而激活下游的核转录-kB（nuclear factor-kappa B，NF-kB）通路。随着病毒感染，ACE2被降解，血清血管紧张素II升高，激活血管紧张素受体1（angiotensin receptor 1，ATR1），导致蛋白质分解酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17）被活化，ADAM17可剪切肿瘤坏死因子a（tumor necrosis factor a，TNFa）前体、白介素6受体α（interleukin-6 receptor a，IL-6Ra）为TNFa、IL-6，并与其他炎症相关分子进一步激活信号传导和转录激活因子（signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3）。该过程中过度激活的NF-kB和IL-6-STAT3炎症途径可引起细胞因子释放综合征，导致肺水肿等急性肺损伤症状。其中ATR1、ADAM17、TNFa等都有望作为研发治疗药物的靶标[22]。
针对SARS-CoV-2的治疗靶点，目前研究较多的是中和抗体，主要在SARS或新冠肺炎恢复期患者的B细胞以及现有抗体库中筛选。考虑冠状病毒的高频率突变型，筛选靶向保守结合表位的中和抗体尤为重要，但即使识别保守结合表位的中和抗体也无法识别所有突变病毒，所以"鸡尾酒疗法"将提供一种新的治疗策略。而且Mpro、RdRp作为病毒关键酶也是抗病毒的药靶。在疾病感染早期，宿主细胞表面分子以及TMPRSS2拮抗剂发挥重要作用，但在疾病后期NF-kB和IL-6-STAT3通路中的关键因子也是抗病毒的潜在药物靶点。目前，针对SARS-CoV-2的药物及疫苗研究仍面临着诸多挑战，但研发更多治疗性药物靶点仍是对抗新冠肺炎强有力的手段。
所有作者均声明不存在利益冲突
