胆道闭锁(biliary atresia，BA)是新生儿期肝内外胆管炎症、肝纤维化、造成新生儿梗阻性黄疸的疾病，病情进展迅速，预后差。其发病机制与遗传、病毒感染、毒素、免疫异常等多种因素有关，目前尚无明确定论。固有免疫系统在其发病和疾病进展中起着重要作用，本文现就固有免疫调控在胆道闭锁胆管炎症和胆管上皮细胞损伤中的作用进行综述。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
胆道闭锁(biliary atresia，BA)是造成新生儿梗阻性黄疸的常见原因，病理表现为肝内外胆管的进行性炎症和肝纤维化。目前Kasai肝门空肠吻合术是胆道闭锁的首选治疗方法，但多数患儿的肝内胆管破坏和肝纤维化在重建胆汁引流后仍会继续进展，导致多种并发症的发生，最终仍需肝移植治疗[1]。胆管炎是Kasai术后最常见的并发症。在一项包含了160例患儿的预后研究中，78.8%(126/160)的患儿在术后出现了胆管炎，其中76.2%(96/126)的患儿在随访期多次发生胆管炎[2]。因此，对BA胆管炎症相关机制的深入了解有助于为临床干预提供更多证据，以便做出更好的临床决策，改善BA患儿的生存和预后。
关于BA的发病机制现有多种学说，包括病毒感染、毒素、基因突变、免疫异常等。其中获得公认的是"病毒感染引发免疫反应"学说。支持这一学说的证据之一为在胆道闭锁患儿的肝脏及胆管组织标本中可以检出风疹病毒(rubella virus，RV)、轮状病毒(rotavirus，ROV)、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、EB病毒(epstein-barr virus，EBV)等病毒[3]。其二，动物实验证实病毒感染可以诱导小鼠产生类似BA的病理改变，且在对恒河猴轮状病毒(rhesus rotavirus，RRV)诱导的小鼠模型中发现RRV病毒VP4基因的关键三肽氨基酸序列"SLR"可以与胆管上皮细胞膜蛋白HSC70结合，在激活免疫系统和诱导发生BA中起着重要的作用[4]。然而，抛开对"始动因素"的争议，很多学说都拥有一个共同指向，即免疫反应引起的胆管损伤。近年来，有许多学者开展关于BA相关免疫反应的研究，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞介导的体液免疫反应、Th1/Th2/Th17等辅助性T细胞和调节性T细胞(Tregs)的调控作用、固有免疫应答、自身免疫反应等[5]。目前，对适应性免疫应答，尤其是T淋巴细胞介导的细胞免疫研究较多，而关于B淋巴细胞介导的体液免疫以及胆道固有免疫、自身免疫反应的研究报道相对较少。
固有免疫系统是人类在漫长的进化史中建立的一套防御体系，其组成包括组织屏障、固有免疫细胞、固有免疫分子，是机体对抗病原体感染的第一道防线。在对抗病毒感染时，固有免疫系统起着至关重要的作用。组织屏障可以限制病毒的侵犯和扩散，并且释放固有免疫分子，限制病毒的生存和复制，同时还可以促进固有免疫细胞活化和募集。固有免疫细胞可以通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)并迅速引发非特异性炎性反应，通过释放固有免疫分子、杀伤感染细胞、吞噬被破坏的感染细胞和病毒产物等多种途径清除病毒感染。干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素、补体、溶菌酶等都属于固有免疫分子，它们可以通过抑制病毒、破坏感染细胞、调节免疫细胞功能等途径，直接或间接地对抗病毒感染[6]。Toll样受体家族(toll-like receptors, TLRs)是4种PRRs家族类型中研究最多的1种，在巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤(nature killer，NK)细胞、中性粒细胞等固有免疫细胞以及胆管上皮细胞中都有丰富的表达。胆道发生病毒感染时，胆管上皮细胞可以通过TLR3识别病毒单链RNA，通过TLR7识别病毒双链RNA；经TLR3-TRIF/MAPK信号激活NF-κB和干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)或经TLR7-MyD88通路激活NF-κB和干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)IRF7，促进Ⅰ型干扰素、白细胞介素、趋化因子等固有免疫分子的释放，迅速激活、募集固有免疫细胞对抗病毒感染[7]。研究指出，在RRV诱导的BA小鼠模型中，TLR3相关的MAPK信号通路的3个关键蛋白及下游转录因子IRF3的表达明显上调；并且在阻断MAPK信号通路后，病毒复制及胆管损伤显著减轻[8]。同样，我们在RRV诱导的BA小鼠模型中发现，TLR7和下游信号IRF7的表达显著上调；在培养的胆管上皮细胞系中，我们发现沉默TLR7的细胞株对RRV更易感，提示TLR7具有对抗病毒感染的保护作用[9]。诸多研究表明，固有免疫应答参与调控胆道的炎性反应和胆管上皮细胞损伤，在BA的发生中起着不可忽视的作用。
除了调节胆汁成分和其流动之外，胆管上皮细胞还具有构成胆管上皮组织屏障的生理功能。胆管上皮组织屏障是胆管固有免疫系统的重要组成部分，也是肝脏抵御损伤因素的第一道防线，除了抵御病原体侵袭之外，还可以阻止有毒物质从胆汁中扩散到肝间叶组织，具有重要保护作用。
胆管上皮细胞损伤也就意味着胆管上皮组织屏障功能受损，而组织屏障受损会降低肝脏和胆管的抵抗能力，增加感染和损伤风险，导致胆道炎性反应的反复或迁延。损伤的胆管上皮细胞会释放大量损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，被固有免疫细胞通过PRRs识别并作出反应，进而加重胆道炎性反应、促进胆管上皮细胞坏死或凋亡[5]。此外，胆管上皮组织屏障受损会使肝脏暴露于来自胆汁内的有害物质，造成肝损伤，还会造成胆汁成分改变、胆汁流动失调、甚至胆汁淤积，促进BA发生[10]。胆管上皮的紧密连接也是维持胆管组织屏障正常功能所必须的，结扎大鼠胆管可以通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的细胞信号途径造成胆管上皮紧密连接破坏；活性氧(reactive oxygen species，ROS)等DAMPs也可以通过酪氨酸磷酸化的途径破坏上皮紧密连接从而破坏上皮的组织屏障功能[11]。
固有免疫细胞是固有免疫系统的主体部分，具有促进和维持炎性反应、杀伤或诱导感染细胞凋亡和清除病原体的能力，其中自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞是主要的效应细胞。
NK细胞是导致胆管上皮细胞损伤最主要的效应细胞，与BA的发生密切相关。NK细胞根据表型可以分为CD56-和CD56+两个亚群，前者杀伤性强，后者杀伤性弱；血液循环中的NK细胞以杀伤性强的CD56-为主，约占90%[12]。血液循环中的NK细胞大多处于休眠期，病毒感染时，在炎性细胞因子和趋化因子的刺激下，这些细胞可以被激活并移动到感染部位杀伤感染细胞。
活化的NK细胞被募集到感染部位，随即释放IFN-γ、颗粒酶、穿孔素等毒性因子损伤胆管上皮细胞，或通过NKG2D配体结合胆管上皮细胞的RAE1受体以细胞接触的方式定点杀伤感染的胆管上皮细胞[13,14]。CD56+NK细胞毒力较弱，但它可以释放大量固有免疫分子，进而募集更多的固有免疫细胞放大炎性反应，同时增强其他杀伤细胞的细胞毒力，间接促进胆管上皮损伤。在BA患儿肝组织中有大量NK细胞存在，包括NKG2D在内的多种细胞损伤相关基因的表达也显著上调[13]。在病毒诱导的BA小鼠模型中，减少BA小鼠的NK细胞数量、阻断NKG2D均可以阻止BA的发展[14]。Okamura等[15]发现BA患儿肝组织中毒力弱的CD56+NK细胞数量显著增多，这与病毒感染后胆管上皮细胞的趋化因子CX3CL1的表达上调，可以被CD56+NK细胞表达的受体CX3CR1识别而促进其募集有关。研究发现，在小鼠模型中存在一个短暂的"免疫间隙"，即在出生12 h接种RRV，小鼠BA发生率为86%，病死率为100%；在出生24 h接种RRV，小鼠BA发生率为65%，病死率为69%；成年小鼠接种RRV，则不会发生BA，这种现象与NK细胞的细胞毒力有关[16]。在BA患儿和BA小鼠的肝组织中，高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)、TLR-2，4的表达均上调，而通过HMGB1-TLR2/4-MAPK信号通路激活的NK细胞对RRV感染的胆管上皮细胞具有更强的杀伤力[17]。而未经RRV诱导处理的正常7日龄小鼠的NK细胞中，TLRs的表达明显高于新生小鼠，且移植成熟的NK细胞可以降低RRV感染的新生小鼠的BA发生率和病死率，提示可能是新生小鼠NK细胞中TLRs的表达不足限制了其对感染胆管上皮细胞的杀伤力，因此无法及时清除病毒感染，造成胆管上皮持续的炎性损伤并最终导致了BA的发生[17]。
树突状细胞(dendritic cells，DCs)是机体功能最强的抗原递呈细胞，处于机体免疫调控的中心环节。DCs的功能不是杀伤感染细胞或清除病原体，而是通过释放炎性因子募集和激活其他固有免疫细胞以及提呈抗原，以激活T细胞启动特异性免疫应答。人体内大部分DCs处于非成熟状态，未成熟DC迁移能力较强，在摄取抗原或受到某些刺激信号时即分化成熟。
DCs根据来源可大致分为髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell，mDC)和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells，pDC)，其中参与识别和对抗病毒感染的主要是pDC[18]。胆管上皮发生病毒感染时，未成熟的pDC迁移到感染部位，接受到病毒核酸分子刺激后，经TLR7/9-IRF7信号通路，在短时间内释放大量Ⅰ型干扰素(interferon，IFN)对抗病毒感染，还可以激活NF-κB，产生IL-6、IL-15、IL-17A、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等细胞因子募集NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞，产生炎性反应，介导胆管上皮损伤[18,19]。pDC还可以通过释放IL-15和表达RAE1受体激活和维持NK细胞的细胞毒力，促进NK细胞杀伤胆管上皮细胞。BA患儿肝组织中pDC数量显著增加，在动物实验中，清除小鼠pDC或阻断IL-15信号均可以阻止BA的发生，使小鼠获得长期存活[19]。
巨噬细胞具有异质性，在不同组织微环境信号诱导下表现出不同功能，可以发挥促炎性作用，也可以发挥抗炎性作用。目前认为，巨噬细胞存在一个连续的功能状态，而M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞分别代表了这一连续状态的两个极端。M1型巨噬细胞提呈抗原能力强，分泌促炎细胞因子和趋化因子发挥正向免疫作用；M2型巨噬细胞提呈抗原能力弱，分泌抑制细胞因子下调免疫应答[20]。
病毒感染时，促炎组织微环境使巨噬细胞表现出M1型功能，在炎性细胞因子的趋化作用下，向感染部位移动、聚集。通过PRRs识别来自病毒的PAMPs、来自损伤细胞的DAMPs，吞噬坏死细胞碎片和病毒产物，同时产生多种趋化因子(如Mip2、Cxcl2)募集更多的炎症细胞到感染部位，还释放多种促炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1β)以维持局部炎性反应，加剧胆管上皮损伤。实验证实，在小鼠肝巨噬细胞系中，RRV感染会引起Mip2及Cxcl2的分泌；而在相应受体Cxcr2缺陷的BA小鼠模型中，胆管上皮细胞损伤和肝内外胆管炎症减轻，证明巨噬细胞在介导BA胆管上皮细胞炎症和损伤中具有重要地位[21]。活化的肝巨噬细胞可以分泌IL-18诱导DCs释放IFN-γ，还可以通过Fas-FasL途径诱导肝细胞凋亡，利用免疫组织化学染色、超声造影定量分析技术都证实了在BA患儿肝组织中肝巨噬细胞数量显著增多[22]。虽然在对抗感染时起着关键作用，但在病毒感染清除后，巨噬细胞就需要尽快撤离损伤位点，结束炎性反应。继续存在的巨噬细胞不利于损伤组织的恢复，但目前关于巨噬细胞退场的机制和过程尚不明确。
中性粒细胞具有很强的趋化作用，可以快速迁移到目标位点，与产生趋化因子的异物接触后将其吞噬清除。除了应对细菌和真菌感染，中性粒细胞在宿主防御病毒感染中也起着重要作用。病毒感染时，中性粒细胞是最早募集到感染位点的固有免疫细胞之一。除了炎性固有免疫分子的趋化作用外，中性粒细胞的募集还与它通过TLRs识别病毒PAMPs引起的MyD88/TRIF信号激活密切相关[23]。病毒和病毒衍生物是中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophils extracellular traps, NETs)产生的强诱导剂，可以通过中性粒细胞TLR7受体诱导NETs的产生和释放[24]。到达感染部位后，中性粒细胞通过细胞膜上的受体以及NETs捕获病毒，将其吞噬、降解，并且分泌细胞因子、毒性蛋白、颗粒酶等固有免疫分子保护组织细胞、对抗病毒感染，还可以释放大量ROS通过损伤病毒DNA灭杀病毒，并诱导病毒感染细胞凋亡从而限制病毒传播[25]。
中性粒细胞可以对抗病毒感染、保护组织，但其过度激活或者过度脱颗粒也会造成组织损伤。过度释放的NETs会导致过度炎症从而造成组织损伤，中性粒细胞颗粒蛋白对上皮细胞产生细胞毒性、ROS破坏上皮的紧密连接、中性粒细胞吞噬病原体同时会产生大量的过氧化物及超氧化物等细胞毒性效应分子，这些都是中性粒细胞在胆道病毒感染时造成胆管上皮细胞损伤的机制[24,25]。BA患儿的肝组织中中性粒细胞数量明显增多，增生的小胆管中出现中性粒细胞浸润，清除Gr-1+的中性粒细胞可以使BA小鼠的症状改善。外周血中性粒细胞相关产物(NETs、颗粒蛋白、IL-18)的高水平表达是BA患儿临床预后差的信号，表明中性粒细胞参与了BA的发生和进展[26,27,28]。
肥大细胞(mast cell，MC)可通过表达ST2受体，在IL-33的激活下释放多种炎性介质，且BA患儿肝组织中MC显著增多提示临床预后差[29]。固有淋巴细胞(innate lymphoid cells，ILCs)是定植在组织中的一类淋巴细胞，在功能上ILC1、ILC2、ILC3分别与CD4+的Th1、Th2、Th17细胞类似，而后者在BA发生和进展中起着重要的作用，且ILC1分泌炎性细胞因子的功能以及ILC2在胆管上皮细胞损伤修复中的重要作用均已经得到证实，提示ILCs在BA的发生和进展中也具一定作用[30]。γδT细胞在肝中大量存在，且具有不同的表型和功能，除分泌IL-17A、IFN-γ等细胞因子外，还在病毒性肝病中还发挥着细胞毒性作用，可以杀伤肝细胞[31]。这些固有免疫细胞在BA的发生和进展中的作用目前还比较模糊，其中还有很多潜在机制需要我们去探究。
固有免疫分子贯穿在整个固有免疫应答中，起识别和传递信号、调控固有免疫细胞，或参与杀伤、清除病原体感染的一系列分子化合物。细胞因子、固有免疫相关受体、防御素、抗菌肽、酶等都属于固有免疫分子。细胞因子是最主要的一类固有免疫分子，它们和相应的细胞因子受体一起构成了固有免疫细胞、组织细胞、病原体之间复杂交互的信息网络，调控着整个固有免疫系统的功能，是固有免疫应答的核心。其中Ⅰ型干扰素是对抗病毒感染的关键细胞因子，它可以促进抗病毒蛋白的释放间接抑制病毒复制，还可以活化NK细胞和巨噬细胞。胆管上皮细胞在病毒感染后可以分泌Ⅰ型干扰素、IL-6和IL-8等白细胞介素、MCP-1等趋化因子激活和募集固有免疫细胞。激活后的固有免疫细胞会释放更多细胞因子，包括干扰素、白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子、生长因子等，放大并维持炎性反应，促进胆管上皮细胞死亡或凋亡。
激活的固有免疫细胞还可以释放一系列细胞毒性固有免疫分子，如NK细胞可以分泌颗粒酶和穿孔素、中性粒细胞可以分泌颗粒酶和ROS，这些毒性分子在清除病毒感染的同时可以损伤胆管上皮细胞。炎症小体也是一类重要的固有免疫分子，是由胞质PRRs参与组装的多蛋白复合物，具有促进炎性细胞因子成熟、诱导细胞程序性死亡等功能。NLRP3炎症小体在识别来自病毒的PAMPs和来自胆管上皮细胞的DAMPs后激活，引起蛋白水解酶Caspase-1的活化、促进IL-1β和IL-18的成熟释放、诱导胆管上皮细胞死亡，造成胆管炎症和胆管组织损伤。研究证明，NLRP3炎症小体的相关基因在BA患儿及BA小鼠模型中的表达均显著提高，沉默相关基因可以减少小鼠肝DCs和NK细胞的数量、降低促炎性细胞因子的水平、减轻胆管损伤，从而避免BA发生[32]。
综上所述，固有免疫系统在BA胆管上皮细胞炎症和损伤中扮演着重要角色，BA的发生与固有免疫系统的调控密切相关。同时关于固有免疫系统在BA发生、发展中作用机制的研究还有待深入，其中还有很多方向和假说需要实践和验证、还有很多疑问和限制亟待解决和突破、还有很多盲区和潜在机制需要去探索与发现。
所有作者均声明不存在利益冲突
