原发性免疫缺陷病(PID)是严重影响儿童生命健康的疾病，尽早识别、及时干预是改善预后的关键。部分PID在新生儿期即出现临床警示症状，然而由于PID种类繁多，早期识别PID仍存在巨大挑战。目前已经有基于干血纸片的PID筛查手段，包括TREC筛查SCID及其他T淋巴细胞减少性疾病，KREC筛查XLA及其他B细胞减少疾病，多重蛋白谱分析筛查补体及吞噬细胞缺陷等。随着基因测序技术的发展，二代测序技术在新生儿PID筛查应用具有很好的前景。目前亟需建立起我国的新生儿PID筛查流程，文章就新生儿PID筛查进展做一综述。
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原发性免疫缺陷病(primary immunodeficiency disease，PID)是一组累及免疫细胞和免疫分子的疾病。根据2019年国际免疫学会联盟专家委员会分类更新PID可分为十大类[1]，包括影响细胞和体液免疫的免疫缺陷、伴有综合征表型的免疫缺陷、以抗体缺陷为主的免疫缺陷、免疫失调性疾病、先天性吞噬细胞数量和(或)功能缺陷、天然免疫缺陷、自身炎症性疾病、补体缺陷、骨髓衰竭和拟表型的免疫缺陷等。既往认为PID为罕见病，发病率约为1/50 000～1/10 000出生婴儿，而随着分子诊断技术的不断提高，预计PID发病率可能更高(约1/5 000)[2]。本文就新生儿期如何早期识别PID的研究进展作一综述。
PID的临床表现并不仅仅局限于免疫系统，可以出现肺部、消化、皮肤黏膜、神经、骨骼等多个系统的症状。因此导致PID常常不能被及时诊断，尤其是在新生儿期。我国常规出生后即接种卡介苗，2月龄接种脊髓灰质炎疫苗，对于潜在的PID患者生后早期活疫苗的接种会造成严重的后果[3]，包括卡介苗有害效应、播散性卡介苗感染、脊髓灰质炎、甚至慢性排毒等[4]。另外，PID患者早期识别、及时干预可以改善预后。研究显示在重症联合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease，SCID)患者3.5月龄前进行造血干细胞移植(HSCT)生存率为95%，而患者发生了慢性腹泻、严重感染后进行HSCT生存率降低至69%，提示了早期识别PID的重要性[5]。
提高儿科医生对于PID尽早发现和治疗的能力至关重要。2011年有学者提出了生后1年内PID的12条警告信号，包括：(1)严重和(或)持续性真菌、病毒或细菌感染；(2)对活疫苗尤其是卡介苗的不良反应；(3)持续性糖尿病或其他自身免疫和(或)炎症表现；(4)病原培养阴性的临床脓毒症；(5)广泛的皮肤病变；(6)持续性腹泻；(7)先天性心脏病(主要是圆锥动脉干异常)；(8)脐带脱落延迟(> 30 d)；(9)PID家族史或存在感染造成的早期死亡；(10)持续淋巴细胞减少<2.5×109/L或其他血细胞减少或无感染状态白细胞增多；(11)低钙血症伴或不伴惊厥发作；(12)胸片未见胸腺影；从临床症状和可获得低成本的检查帮助临床医生尽早识别PID[6]。
部分PID疾病在新生儿期即可出现疾病症状，SCID患儿可以出现耐药性或机会性感染；红皮病的存在应引起对Omenn综合征和母源性T淋巴细胞植入的怀疑[7]；新生儿出现湿疹伴有严重/反复感染，应增加对X连锁多内分泌腺肠病伴免疫失调综合征(immune dysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy X-linked syndrome，IPEX)、Wiskott-Aldrich综合征(Wiskott-Aldrich syndrome，WAS)、高IgE综合征(hyper IgE syndromes，HIES)等疾病的怀疑；男性患儿持续的血小板减少需要考虑WAS[8]，患有严重葡萄球菌感染考虑HIES；黏膜异常(如鹅口疮和口腔溃疡)可能反映STAT3、STAT1功能获得性突变的潜在缺陷[9]；脐带脱落延迟超过2周是白细胞黏附分子缺陷(leukocyte adhesion deficiency，LAD)的特征[10]；早发持续腹泻怀疑IL-10和IL-10受体缺陷[4]等等。重点筛查高危新生儿被证明是诊断PID疾病的一个有价值的策略。然而，新生儿期免疫系统不成熟、逐渐发展，例如母亲胎传抗体IgG的存在导致抗体缺陷病患者无感染表现，黏膜屏障和细胞免疫尚未完善增加了感染风险，骨髓储备空虚导致脓毒症后发生中性粒细胞减少；这可能干扰PID的早期临床识别。
一旦怀疑新生儿患有PID，应该对免疫系统做进一步的检查，如全血细胞计数，免疫球蛋白定量和淋巴细胞亚群等免疫功能评估，但仅仅通过临床线索识别PID是远远不够的。出现症状前的疾病诊断十分必要，新生儿期的PID早期筛查逐渐得到了全世界的重视。
SCID是最严重的PID类型，患者常在生后1年后死亡，疾病的早期发现直接影响预后。多种遗传因素造成患者的T淋巴细胞数量缺乏和(或)功能障碍，导致细胞免疫、体液免疫同时存在严重缺陷。T淋巴细胞约占外周淋巴细胞70%，经典型的SCID患者T淋巴细胞计数明显减少(小于300/μL)[11]，因此血常规淋巴细胞绝对计数最初作为对SCID的筛查手段之一。但部分SCID患者可以发生母源性T淋巴细胞植入和Omenn综合征，不伴有全血淋巴细胞计数的明显减少，并且儿童生后早期并不常规进行血常规采集。中位采血时间为84日龄的研究显示[12]，血细胞计数对SCID的检出缺乏敏感性(敏感度为56%)。流式细胞术作为SCID的诊断方法之一，可以检测不同淋巴细胞亚群的比例及数量，但其作为筛查手段可能是费时费力的。
SCID最显著的特征是初始T细胞缺乏。TRECs是初始T细胞中的T细胞受体(TCR)重排过程中形成的游离环状DNA小片段。这些DNA片段稳定存在，不易于降解，不随T细胞的分裂而复制，并特异于初始T细胞，因此分析TRECs可以间接反映胸腺输出的初始T淋巴细胞数量，应用于SCID的筛查[13]。识别SCID患儿是基于TREC新生儿筛查的预期目标，另外TREC筛查还会识别出其他原发或继发原因导致的T淋巴细胞减少，例如22q11微缺失综合征、共济失调毛细血管扩张症、联合免疫缺陷、DOCK8缺陷、WHIM综合征、21-三体、18-三体、Kabuki综合征、CHARGE综合征、血管渗漏、早产、特发性T淋巴细胞减少症等疾病[14]。大样本筛查结果显示SCID的发生率高于预期，约为1/58 270，临床相关T淋巴细胞减少的发生率约为1/7 370[15]。
TREC拷贝数通过荧光定量PCR(qRT-PCR)进行测定，与苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能低下、G6PD缺乏等其他的新生儿常规筛查项目共用干血纸片(dried blood spots，DBS)，有利于该筛查方法的大范围推广。2005年，Chan等[16]首次描述了TREC检测在大规模筛查SCID和其他形式T细胞淋巴细胞减少症中的应用。2008年美国威斯康星州率先利用TREC进行人群的SCID筛查，3年时间内共207 696例新生儿接受筛查，筛查的灵敏度为100%，特异度为99.98%[17]。随后美国在各大洲开展TREC新生儿常规筛查。2010年北美原发性免疫缺陷联盟研究中90%的SCID新病例是通过家族史或感染发生后确诊，而2016年统计显示美国诊断的SCID患者中90%是通过筛查捕获[18]，TREC筛查彻底改变了在症状前阶段检出SCID的能力，显著改善了患有SCID儿童的预后。目前约92%的美国婴儿接受筛查，在世界范围内，荷兰、英国[19]、法国[20]、西班牙、巴西、土耳其、中国台湾[21]等国家和地区也开展了TREC新生儿筛查，筛查的发展帮助更准确地估计SCID的发病率。
早产儿和新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit，NICU)中的婴儿是异常TREC结果的主要来源。有研究共993 724个样本中，879例婴儿的初始TREC值低于可接受的临界值，其中NICU的贡献率高达85%；二次DBS检测异常后续被召回接受流式细胞术淋巴细胞分析的161名婴儿中，66%来自NICU[22]。开展TREC筛查后需要进一步免疫检测排除PID的NICU患儿增加了3倍[23]。对于筛查阳性疑似SCID的新生儿，建议立即隔离，避免活疫苗的接种，评估母亲巨细胞病毒感染；请免疫学家会诊评估，进行系统性的病史、家族史、体格检查。若TRECs减少或缺失高度怀疑SCID，进一步随访行流式细胞术、免疫球蛋白及基因检测确诊。新生儿期SCID筛查被认为具有显著的成本效益，促进了患儿症状前疾病的尽早发现、及时治疗，改善了结局[24]。
XLA及其他类似XLA的B细胞缺失，IgG、IgM等免疫球蛋白均减低，造成反复的细菌及肠道病毒感染，及时IVIG替代治疗对减少疾病并发症和改善生活质量至关重要。但由于母传抗体的存在，患儿生后早期可不发病，复发感染出现在3至18月龄，而诊断时的平均年龄为3岁[25]，诊断年龄的明显延迟提示了需要早期识别。像T细胞一样，B细胞在发育过程中也会经历V(D)J重组产生独特的B细胞抗原受体(BCR)，并且该过程还产生游离环状DNA片段成为KREC。van Zelm等[26]描述并开发了一种基于PCR的方法进行KREC分析以量化B淋巴细胞亚群的复制。2011年首次证明了KREC检测可用于识别B细胞缺陷疾病新生儿，XLA患儿的血液和DBS标本中未检测到KREC[27]。KREC检测具有新生儿大规模筛查鉴定早期B细胞成熟缺陷的潜力。
并非所有严重的T细胞疾病都可以通过TREC筛查来识别，部分迟发性ADA缺陷、ZAP70缺陷和MHC Ⅱ类分子缺陷等患儿可能有正常的TRECs，而出现TREC筛查阴性结果。迟发性ADA缺陷患者可能T细胞分裂对有毒代谢产物增加的耐受性较好，而B细胞更容易缺乏，单独TREC分析会造成漏诊[28]。联合其他筛选标记TREC/KREC被认为是可以帮助检出泄漏型(leaky SCID)和迟发型SCID[29]。有研究根据曲线建立界值15 TRECs/μL和14 KRECs/μL对SCID和无丙种球蛋白血症检出敏感度均为100%[30]。目前瑞典[31]、西班牙[32]、波兰-德国和巴西[30]等国家已经联合TREC/KREC检测进行T/B细胞缺陷的新生儿筛查。然而，联合TREC/KREC筛查仍可能会漏诊部分功能缺陷的SCID。
补体缺乏症会导致反复持续发作的上呼吸道感染，反复肺炎球菌和脑膜炎球菌感染，遗传性血管性水肿，自身免疫性并发症以及非典型溶血性尿毒症综合征和肾小球性肾炎引起的肾衰竭[33]。严重的先天性中性粒细胞减少症特征是中性粒细胞数量减低，慢性肉芽肿病为NADPH氧化酶途径受损粒细胞呼吸爆发功能缺陷，导致深部脏器感染、伤口愈合延迟和脓肿形成等症状，易感染细菌、真菌、结核等病原，还可以发生炎症表现[34]。疾病严重者甚至致命，并可能导致恶性肿瘤或骨髓衰竭，早期诊断可以进行HSCT治疗，未来有基因治疗的前景。
补体功能测定、比浊法、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定、全血细胞计数和流式细胞仪呼吸爆发功能可用于诊断补体和吞噬障碍，但不适用于人群筛查。基于蛋白质的筛查方法可以作为鉴定患有补体和粒细胞缺陷新生儿的手段。从DBS中洗脱并进行C2和C3等特异性补体蛋白定量，能够识别出生时蛋白质水平低下或检测不到的新生儿[35]。2020年开发了一种基于悬浮珠阵列技术的新生儿筛查方法[36]，并行分析常见补体、吞噬细胞数量和呼吸爆发功能缺陷疾病的相关蛋白。蛋白从DBS洗脱和标记，稀释后在设计的抗体耦联珠阵列上捕获，并用基于荧光的读出法分析信号。总体来说，将新生儿DBS常规流程与多种潜力技术相结合提供了一个很有吸引力的方向，能较容易地扩展到全国，覆盖更多PID类型的新生儿筛查。
随着基因测序技术的发展，全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)及全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)得到广泛应用。WES可有效地发现孟德尔疾病的病因，分析方法常依赖于多个散发病例和(或)有连锁反应的家系，但也可发现单个病例的遗传原因，具有样本数量少、低费用、高通量的优点，可以大大加快人类疾病基因的研究进程。近年来，快速的二代测序技术(next generation sequencing，NGS)诊断得到了发展，在NICU中得到了很好的应用。采用NGS识别导致疾病的基因变异是一种有前景的NICU患儿诊断工具。快速NGS的周期时间为7～23 d[37]，在26 h内可尽快获得初步结果[38]；快速NGS具有高诊断率，并导致临床患者管理的变化。加拿大一项基于快速家系WES的RAPIDOMICS试点研究[39]，平均的初步诊断时间为7.2 d，总诊断率(部分或完全)为60%。快速NGS的发展为新生儿PID筛查提供了条件。
TREC筛查为未来包括使用WGS和WES的人群筛查铺平了道路。美国的11个SCID新生儿筛查计划筛查了300万以上的婴儿[18]，SCID基因型的分布为19% IL2RG，15% RAG1，11% IL7RA，10% ADA，6% JAK3，还有23%基因未明。通过使用靶向NGS技术可以快速地分子诊断包括SCID在内的严重PID类型，达到特异性诊断及最佳管理[40]。我院对2 392例婴幼儿进行早期基因筛查，51例患儿被确诊为PID，不仅提示PID的发生率远超目前估计的水平，而且证实了基因筛查的价值[41]。2017年Pavey等[42]研究分析了来自健康人群的1 349个新生儿-父母三人的WGS数据，探索NGS技术在新生儿期PID筛查的实用性；396名(29%)新生儿是PID相关基因的单一致病突变或可能致病突变携带者，5名(0.37%)新生儿的基因型被计算预测为PID可疑致病，经过人工分析后只有1名儿童考虑存在C9缺陷。DBS是进行遗传和基因组分析的潜在资源，研究表明可以提取足够的DNA用于NGS，联合PID基因panel对低TREC的新生儿进行DBS筛查可以成为一种新的可靠、快速和具有成本效益的筛查手段[43]。NGS具有提供快速PID分子诊断的潜力[44]，早期识别出与PID相关的特定突变，能够及时启动针对性的个性化治疗选择。
PID新生儿筛查的建立可以帮助在发生症状前早期识别患儿，有助于预防活疫苗接种并发症，获得最佳的治疗机会和手段[45]。我国部分单位如复旦大学附属儿科医院、重庆医科大学附属儿童医院等已经建立起了TREC的筛查检测手段，但由于经济和政策等原因目前在全国范围内缺乏新生儿PID筛查的开展。基于当前的现状"临床模式识别"，医生应该加强对PID早期临床表现及预警症状的认识，才能提前诊断有症状的患者，但这不会取代对新生儿筛查程序的需求；对于发生症状前的PID新生儿筛查尚需要临床医生、机构、政府等共同努力，相信在不远的将来会将PID新生儿筛查充分融入现有体系，建立起我国的新生儿筛查策略。
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