神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童期最常见的颅外实体恶性肿瘤。原发性肿瘤沿着交感神经系统发生，大部分出现在肾上腺髓质，它被认为起源于背主动脉区域的躯干神经嵴细胞，即交感肾上腺祖细胞，这些细胞是交感神经元和肾上腺嗜铬细胞的祖细胞^[1]。NB具有高度的异质性，有多种遗传物质的变异，其中MYCN基因扩增是诱发肿瘤转化的致癌驱动因子，与不良预后相关。NB可以分为MYCN扩增型和MYCN非扩增型两大类^[2]，而家系NB则与生殖细胞ALK突变相关。NB发病年龄早，确诊时转移发生率高，在部分婴儿病例中有自然消退的趋势^[3]。高危NB(high-risk neuroblastoma，HRNB)患儿即便经过多次手术和诱导治疗、大剂量联合放疗、化疗、自体干细胞移植、单克隆抗体Ch14.18维持治疗等高强度治疗预后仍然很差，治愈率<50%^[4]。本研究归纳NB的起源、自然消退、转移、治疗及液体活检等近期相关研究，希望有助于国内同行掌握NB研究热点及其进展的最新动态，为NB相关研究提供参考。

目前，NB细胞的起源问题运用单细胞测序技术已得到初步的研究。Dong等^[5]对人类4、8、14周的胚胎肾上腺进行了单细胞测序，在Palantir分析中发现施万细胞前体(schwann cell precursor，SCP)可向嗜铬细胞(chromaffin cell，CHC)和交感神经母细胞两个方向分化。随后，Kameneva等^[6]通过同类方法得到了类似发现，不同的是：他们认为SCPs分化产生的肾上腺内交感神经母细胞可以转变为嗜铬细胞；而大多数肾上腺外的交感细胞则来源于迁移的神经嵴。两项研究结果的差异可能是由于二者细胞定义所用的基因不同。CHC和神经母细胞在由桥细胞过渡的SCPs到连接祖细胞(中间的过渡细胞群)阶段处于同一分化轨道，然后轨道分叉。因此，SCPs位于肾上腺髓质分化的根部。在单分子RNA FISH分析发育中的肾上腺髓质细胞类型的定位分析中，单个SCP位于神经母细胞巢内，巢周围有小群嗜铬细胞^[7]，这也支持了SCPs向CHC和神经母细胞分化的理论。人类的这一过程在肾上腺内神经节样组织的发育阶段持续数周，肾上腺内神经节样组织可能是NB原始细胞的储存库。类似的，Jansky等^[7]的测序研究观察到了NB在转录上与正常胎儿肾上腺神经母细胞相似性。而Hanemaaijer等^[8]则通过TARGET RNA-seq数据库评估比较了所有肾上腺组和髓质簇的前20个基因在NB中的表达情况，证实了两者的相似性。以上研究都强烈提示NB起源于神经母细胞谱系。

目前的观点认为，NB是在移行性神经嵴细胞分化过程中发生的，且已在神经母细胞中发现多个参与癌基因增强子挟持事件的基因，这表明神经母细胞谱系较易获得促进NB发生的基因改变^[7]。有研究观察到的NB的肾上腺素能细胞成分与正常交感神经元相似，这提示交感神经母细胞可能是一个肿瘤起源点；在少数NB细胞系中发现的具有SCPs特征的恶行间充质细胞可能暗示另一个起源点。然而，Dong等^[5]的研究中，与其单细胞测序结果一致的是，MUSIC反卷积算法分析提示绝大多数NB样本含CHC表型样肿瘤细胞比例较高；在MYCN扩增阳性的患儿中，上皮间质转变神经嵴细胞(epithelial-to-mesenchymal transition-neural crest cell，EMT-NCC)表型样肿瘤细胞比例较高，后者是因为MYCN靶基因与EMT-NCC表达基因高度重叠，而非肿瘤起源于EMT-NCC。在比较肾上腺髓质细胞群和NB细胞的转录谱后，研究者发现不同临床表型的NB沿着正常的神经母细胞分化轨迹匹配不同的时间状态，分化程度与临床预后相对应^[7]。低风险NB发生于发育中较晚的时间点，而高风险NB发生较早。比如MYCN扩增和具有间充质特征的NB是分化程度最低的亚型，具有早期神经母细胞和桥细胞的特征。

NB的动物实验多采用小鼠模型。小鼠与人不同的是，其体内部分肾上腺内交感神经元主要由SCPs通过一个不成熟的嗜铬状态分化来，从SCPs到不成熟的CHC，再到交感神经细胞的2个过程由两群不同的桥细胞分别过渡，这仅在大量测序时才易检出；而在人类中则直接从分化来^[6,7]。小鼠的肾上腺内外交感神经细胞相比，前者发育时间点较晚，但表型差异并不明显^[7]。人和鼠的这些差异可能是由于神经母细胞基因在发育轨迹上的不同时间表达，某些基因在小鼠中比在人类中上调得更早，因此小鼠模型系统难以完全重现人类NB。

在一些婴儿NB(如4S期)病例中，可以观察到肿瘤自然消退现象。4S期患儿通常有局限性的原发肿瘤，虽然肿瘤转移到肝脏、皮肤或骨髓，但预后良好，即使未进行抗肿瘤治疗，大多数也能自然消退。Brodeur等^[9]总结了有证据支持的NB自然消退的几种可能机制：①神经营养因子缺乏；②端粒酶活性丧失；③体液或细胞免疫；④表观遗传调节和其他机制的改变。

近来，与NB自然消退相关基因的研究已取得一些进展。在多种消亡机制中，自噬是一种高度保守的稳态途径，自噬在4期NB下调，在高危人群中未发现自噬基因集高表达，其与NB细胞的凋亡和分化有关。Meng等^[10]通过比较4S期和4期NB样本，鉴定了差异表达的自嗜相关基因和相关的lncRNAs。矛盾在于：属于自嗜正向调节基因的GABARAPL1在自噬启动之前激活可以促进NB细胞存活，而在最新研究中它与肿瘤抑制相关^[10]。骨髓嗜病毒整合位点2(myeloid ecotropic integration site 2，MEIS2)与细胞分化相关，是NB细胞M期进展所必需的。前人文献提示MEIS2蛋白是肿瘤抑制因子^[11]，实则不尽然。MEIS2剪接异构体控制着NB生长和分化的平衡，MEIS2A和MEIS2D发挥拮抗作用。MEIS2A特异共沉淀蛋白CDK11B的基因位于染色体1p36.2-36.3，这是NB中染色体频繁缺失区域。在TARGET-122RNA测序研究中，异构体MEIS2A的mRNA水平在3期和4期NB中显著低于4S期；已在细胞实验和动物实验中观察到MEIS2A的表达显著抑制细胞增殖，并且促使分化^[12]。据此推测，MEIS2A可能在自然消退中发挥重要作用。此外，先前的研究已发现BMCC1可促进神经生长因子(nerve growth factor，NGF)耗竭进而引起的神经细胞凋亡^[13]，在进一步研究中，Tatsumi等^[14]已在NB细胞中观察到BMCC1通过其C末端BNIP-2同源区抑制Akt介导的生存途径中多个步骤来启动和促进凋亡，阐明了BMCC1的促凋亡机制。

NB自然消退机制的表观遗传学研究也有相应进展。非编码lncRNAs与NB关系密切。例如，LncRNA CASC15-S被发现是NB中的一种肿瘤抑制因子，它通过介导神经生长和分化而发挥作用。Meng等^[15]通过对4期和4S期NB进行差异表达分析鉴定了生存相关lncRNAs，其表达都与自然消退的重要因素NTRK1的表达显著相关。在转录调控方面，可变多聚腺苷酸(alternative polyadenylation，APA)导致RNA3'端出现不同的转录异构体，这种动态变化普遍存在，对应翻译产物也不同，它们通常与分化和去分化有关。Ogorodnikov等^[16]通过RNAi-screening鉴定了PCF11，一个参与转录终止和RNA3'末端成熟的CFIIm复杂成分，是NB的关键调控因子，介导数百个转录本的APA。在NB中存在转录组3'端结构的大量改变，未分化的神经细胞与分化状态相比，表达大量缩短和延长的转录本亚型，其中GNB1是NB自然消退的标志物。PCF11的下调诱导NB细胞系和小鼠神经前体细胞分化；PCF11缺失诱导GNB1转录延长、GNB1蛋白下调和神经分化^[16]。在4S期与4期NB的比较中发现，后者PCF11的表达明显更高，低水平PCF11表达仅见于4S期^[16]，故而PCF11的表达可能与NB自然消退有关，然而PCF11作用仍需进一步阐释。

大约50%的NB患儿在确诊时已经有远处转移，这些病变主要累及骨髓、骨骼、淋巴结和肝脏。肿瘤的转移与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)密切相关，NB也是如此。肿瘤相关的ECM重塑，如胶原沉积增加、纤维排列和交联，导致ECM硬度和机械力增加，使肿瘤转移增加。其中，LOX家族是关键调节因子。Zhu等^[17]发现LOXL3在多种NB组织中显著上调，伴有胶原沉积增加、ECM僵硬；此外，硬化的ECM可以激活细胞表面整合素，触发细胞骨架重塑。病灶粘连的动态组装和解离在细胞迁移过程中起着核心作用。LMO1上调整合素家族基因的表达，进而促进粘着斑复合物的组装和肌动蛋白细胞骨架的重排。LMO1与MYCN协同促进NB的启动和转移，这在NB中普遍显著丰富。高表达LMO1诱导的这些表型共同导致高表达LMO1的细胞的侵袭、运动和转移能力增强^[17]。

转移的NB细胞与原发灶相比已经发生了遗传物质的变异，对应的有特殊表型，从而更容易转移。Abbasi等^[18]的研究发现，与原发肿瘤相比，骨髓来源转移肿瘤细胞(disseminated tumor cell，DTC)和NB复发肿瘤中1q和19q缺失的频率较高。Rifatbegovic等^[19]通过测序发现，DTC与肿瘤相比存在322个差异表达基因(q<0.001，|log₂FC|>2)，在这些DTC中，线粒体DNA编码的转录本水平升高，而血管生成基因则下调；值得注意的是，复发性DTC在19号染色体上显示31个下调基因的位置富集，其中包括5个肿瘤抑制基因。孙健等^[20]在检测并对比了NB原发灶和转移灶基因表达情况后发现，转移组织中RECK基因表达下调，而MMP2及MMP9基因表达上调，这在动物模型中通过芯片杂交技术证实。Zeka等^[21]则通过对转移性和局限性NB患儿外周血miRNA做差异丰度分析发现了9个与转移性4期NB密切相关的miRNA，这些都支持分支克隆进化和原发和转移肿瘤细胞平行发展的假说。关于miRNA的具体机制，周栩平等^[22]发现SNHG1可通过靶向负调控miR-145的表达，增强基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9表达，促进SK-N-SH细胞的增殖、侵袭和迁移能力。同样与NB转移相关的还有SRCIN1基因，Salemme等^[23]发现原发肿瘤中p140Cap蛋白高表达的患儿发生远处事件的可能性较低，编码p140Cap的基因SRCIN1的mRNA水平是独立危险因素，与疾病侵袭性呈负相关，SRCIN1异常改变，如易位、缺失或杂合性丢失，促进了NB的生长、转移和耐药性，这与p140Cap表达的丢失、Src和STAT3/JAK2通路的抑制是一致的。NB等肿瘤的一个特征是聚唾液酸的表达，肿瘤细胞糖酵解产生的丙酮醛的晚期糖基化终产物导致聚唾液酸化增加，可干扰黏附从而促进侵袭和转移，Scheer等^[24]的研究观察到Kelly细胞中聚唾液酸化上调并伴有细胞黏附的减少和侵袭力的增加。

肿瘤的转移与其特有的局部缺氧环境密切相关。生长中的肿瘤持续缺氧似乎与其侵袭能力增强、向病灶周围和远处扩散有关，从而导致临床上的侵袭性表型。在NB细胞中，缺氧促进TRIO和SERPINB9的表达，这2个基因在其他癌症中被认为与转移相关^[25]。

有关NB转移的研究目前仍不足。Yogev等^[26]建立了Th-MYCNCPM32小鼠模型，这种小鼠模型存在化疗耐药和自发性骨髓转移的高危耐药NB特征，并且显示出肿瘤微环境的改变、广泛的转移和对JAK1/2抑制的敏感性。新模型有望推进NB转移的进一步研究。

目前，HRNB多采用高强度治疗策略，包括5、6轮手术和诱导治疗、大剂量联合放疗、化疗、自体干细胞移植和使用单克隆抗体Ch14.18维持治疗，但预后仍然很差。

难治性NB有多种耐药机制，这里只列举了最新的几项研究成果。Coggins等^[27]发现YAP1介导RAS信号过度激活的NB细胞系对MEK1/2抑制剂的抵抗，在曲美替尼作用下YAP1发生核移位，进而转录激活E2F和MYCN来介导MAPK信号高激活的NB细胞对曲美替尼的耐药性。NB细胞内外miRNA也与肿瘤耐药相关，NB细胞和经过TGF-β处理的NK细胞表达下调的肿瘤抑制miR-186，而miR-186抑制NB中的致癌蛋白MYCN和AUKA，也抑制免疫逃逸相关的TGF-β途径的组成部分。恢复NB中miR-186的水平，可恢复NK细胞的杀伤能力，这提示了肿瘤抑制miRNA在NB中的治疗潜力^[28]。

近来，NB的靶向抑制剂有了新进展，CDK9和CDK2的抑制剂Fadraciclib可抑制CDK9导致新生MYCN转录的选择性丢失，使同时抑制CDK2的细胞凋亡变得敏感，与替莫唑胺联用可长期抑制NB生长^[29]，现处于早期临床试验中。新型小分子抑制剂Agerafenib靶向抑制RAF家族激酶可阻断NB细胞ERK MAPK通路的激活，在体外显著抑制NB细胞增殖和集落形成，与传统化疗有协同促凋亡作用，有靶向治疗潜力^[30]。在Mody等^[31]的研究中，伊立替康、替莫唑胺、地努图昔单抗联合GM-CSF在复发/难治性NB患儿中具有显著的抗肿瘤活性，OR率超过40%。抗二唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside，GD2)鼠单克隆抗体、人鼠嵌合抗体现已应用于临床，然而鼠单克隆抗体易引起人抗鼠抗体反应，使疗效减弱，而人抗和鼠抗的嵌合抗体Ch14.18则解决了这个问题，并且能显著改善HRNB的预后^[32]。Shusterman等^[33]的Ⅱ期临床研究提示，Hu14.18-白细胞介素2(IL2)联合粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和异维A酸治疗是安全和耐受的。抗GD2单克隆抗体与GM-CSF、IL2和异维A酸联合使用已在北美用于HRNB微小残留病治疗^[34]。

在细胞治疗方面，Heczey等^[35]进行了抗GD2-嵌合体抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-NKT细胞治疗难治复发NB的临床实验，CAR-NKT细胞在体内扩增，向肿瘤趋化，杀死与肿瘤生长和转移相关的巨噬细胞，还间接促进NK细胞和T细胞抗瘤活性。CAR-NKT细胞治疗的可行性和安全性已得到初步验证。Parihar等^[36]研究了另一种细胞，NKG2D.ζ-NK细胞能分泌促炎细胞因子和趋化因子来响应肿瘤部位的髓系来源的抑制细胞，并改善CAR-T细胞的浸润和抗肿瘤活性。因此，两者联合治疗可能比单独应用更有效。

在其他方面，NB的治疗也取得了进展。使用纳米颗粒使药物靶向肿瘤，这利用了肿瘤的高渗透长滞留效应。纳米颗粒治疗与CPT-11相比，可以延长大多数小鼠的无事件生存期。当用SN38-TOA纳米颗粒再次治疗CPT-11复发的肿瘤时，可观察到NB向成熟的神经节神经母细胞瘤分化^[37]。化疗方面，阿利昔布联合伊立替康和替莫唑胺治疗复发或难治性NB的Ⅱ期试验在MYCN非扩增型中观察到了抗肿瘤活性^[38]。放射治疗方面，基于NB细胞高表达生长抑素受体的肽受体放射性核素疗法(peptide receptor radionuclide therapy，PRRT)有了部分进展。对于常规治疗包括化疗或131I-MIBG无效或复发的NB患儿，177 Lu-DOTATATE联合强化化疗可作为一种无明显的血液学、肝、肾毒性的替代治疗方案^[39]。然而，177-Lu分子放射治疗效果尚存在争议。最后，Eranki等^[40]研究发现，高强度聚焦超声可诱导难治性小鼠NB对检查点抑制剂治疗的免疫增敏，其联合αCTLA-4和αPD-L1可显著增强抗肿瘤反应，对双侧肿瘤进行单侧超声治疗可见显著非局部性效应。