FLT3-内部串联重复（ITD）突变在急性髓系白血病（AML）中的发生率为20%~30%，其通常提示不良预后，尽管FLT3抑制剂的应用使该型AML患者疗效取得了较大提高，但耐药、复发情况也日渐突显。ITD突变使FLT3在无配体存在的情况下发生二聚体化并持续自活化，引起非配体依赖性磷酸化，而不同ITD特性，包括等位基因比率、长度、插入位点、野生型突变含量以及共突变基因等因素，都会影响患者预后，这些因素背后深层次的机制对临床预后、药物应用及治疗策略都有重要的指导意义。
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当前FLT3-内部串联重复（ITD）突变型急性髓系白血病（AML）的治疗方法是"3+7"化疗方案结合靶向治疗，其最大的一个问题是极易发生复发难治及耐药的情况，FLT3抑制剂的原发性和继发性耐药的出现更是为持久治疗带来了挑战。因此探究其背后隐藏的分子学事件和基因克隆进化对更深层次了解该疾病具有重要意义。
癌症的发生可以看成是体细胞突变累积的结果，呈阶梯式获得正常细胞内的突变。有研究经测序发现，大部分髓系肿瘤和AML患者具有2个及以上的驱动基因突变，但大部分克隆造血的样本只有1个可被检测到的基因突变，尽管其中大多数突变为无功能的过客基因突变，不增加血细胞克隆扩张潜力，但随着年龄增长，克隆造血的比率越来越高，且部分突变为驱动基因或血液肿瘤相关基因，如DNMT3A、TET2以及ASXL1，大大增加了AML的产生概率[1]。
AML来源于一个具有自我更新能力的白血病干祖细胞（LSC），其稀少且处于静止状态，易导致耐药及复发的产生。Shlush等[2]研究证实，耐药相关细胞在初诊时已经存在，且通过两种模式复发：一个是原始复发起源（ROP），复发的细胞起源于一些稀有的具有原始干细胞表型的细胞群，在初诊治疗前便已经存在；另一个是持续复发起源（ROC），复发的细胞起源于保留了强转录干性、持续表达CD33+免疫表型的细胞。对复发的LSC研究发现，化疗不会诱导突变，而是筛选已存在的耐药亚克隆，因为LSC的休眠还是表观遗传的可塑性所致，具体原因尚不清楚。
约75%的初诊FLT3-ITD突变AML患者在复发时持续ITD突变状态，有学者认为可能是由于耐药亚群选择、抑制剂旁路机制以及药物活性的不足所导致[3]。他们的临床试验中只有59%的患者通过米哚妥林的治疗达到了完全缓解（CR），但几乎一半的患者最终复发。在疾病进展和耐药产生时，46%的患者达到了FLT3-ITD阴性，但在信号通路中产生了新的突变，因而获得了新的增殖能力。初诊时ITD阴性而复发时阳性的患者，可能是由于克隆进化导致的，也可能是因为ITD突变量太小而在初诊时未检出。
研究证实在杂合FLT3WT/ITD敲入小鼠模型中产生了髓系肿瘤，但小鼠并未发生急性白血病，表明在白血病的产生中还需要其他的驱动基因，这些额外的驱动基因可能包括DNMT3A、CEBPA、MLL3、TET2、ASXL1等，且任何一个额外的驱动基因突变都不足以诱导白血病的发生和发展[4]，是否是因为这些基因单倍体突变量不足导致还有待研究。在克隆进化过程中，基因突变的数量是呈阶梯分布的。在近期的一项单细胞测序研究中发现，从克隆造血到骨髓增殖性疾病再到AML的疾病进展过程中，突变的基因数量逐渐增加，且疾病发展至AML阶段时，克隆进化的过程仍在继续[5]。AML可在原表观修饰基因（DNMT3A、TET2、ASXL1以及IDH1/2）突变的基础上继续获得关键信号分子基因（JAK2、RAS、FLT3）突变。与克隆造血、多发性骨髓瘤以及RAS、FLT3野生型的AML标本相比，RAS和FLT3突变样本具有更高的克隆多样性。几乎所有的表观修饰基因突变都出现在相同的克隆中，且在81%的病例中，表观修饰基因共同突变都占据主导地位，表明主导突变基因之间存在协同作用。而在异常克隆造血的病例中，上述突变基因并没有出现在同一个克隆中，这表明早期的克隆增殖过程都是由表观修饰基因进行独立调控的。与此相反的是，像RAS和FLT3这样的信号通路基因突变，很少出现在相同的克隆中，且几乎不会成为主导克隆。
Wakita等[6]认为额外的二次打击突变基因都是一类基因突变（FLT3、KRAS等），使得细胞增殖能力增强，而二类基因突变（NPM1、CEBPA）都作为第一次打击，抑制细胞间的分化，一定程度上在后续的治疗过程中消失减少，因而提出了存在一个获得细胞增殖能力的前白血病时期。初诊时具有DNMT3A突变患者复发时的FLT3-ITD突变比例远远高于初诊时未发生DNMT3A突变的患者，而那些在复发时具有高比例FLT3-ITD突变的患者，在初诊时大多具有表观修饰基因突变。有学者认为，正是表观修饰基因的突变导致了基因组的不稳定，并诱导FLT3-ITD突变，并导致耐药以及复发。而那些仅在复发时检测出FLT3-ITD突变的病例表明，耐药机制的出现需要一段基因突变的暴露时间。
尽管表观修饰基因DNMT3A、TET2、ASXL1这样的驱动基因突变在疾病的复发和进展过程中持续存在，但是在二次打击中影响信号转导和转录的基因并不稳定[7,8]。因此，复发难治的原因可能是驱动基因获得了新的突变，或是在化疗过程中有亚克隆群进行了耐药选择。
目前对于AR高低组的界定并没有明确的规定，但一般将0.5作为分界点。Schlenk等[9]研究入组患者AR从0.01到10.19不等，中位数为0.53。诱导治疗的结果表明，AR率与CR率呈反比关系。异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）可以在CR1时期极大地改善AR>0.51患者的无复发生存（RFS）和总生存（OS），但不能明显改善低AR组的RFS和OS。研究显示尽管allo-HSCT在低AR组中有一定的临床治疗价值，但不应作为首选的巩固治疗方式[10]。高AR组中allo-HSCT相较于自体造血干细胞移植（auto-HSCT）有着更低的复发率，这可能得益于移植物抗白血病（GVL）效应。相比于巩固化疗，allo-HSCT能明显改善高（>0.51）AR ITD突变在CR1时的OS和RFS。Oran等[11]研究认为，无论AR值高低以及是否伴有NPM1突变，allo-HSCT均可改善FLT3-ITD突变AML患者CR1时的OS和RFS时间。Sakaguchi等[12]研究认为，AR值的高低对于CR1时是否进行allo-HSCT的指导意义不大。AR是否可以作为在CR1期间进行allo-HSCT的一个指标还有待进一步研究。
研究发现合并的突变基因（CEBPA、IDH1/2）和AR之间存在反比关系：AR越高，伴随的分子畸形出现频率越少。Rücker等[13]同样发现，AR值越高，伴随突变的数量就越少。
ITD的插入点可根据FLT3接受位点的功能分为Juxta膜结构域（JMD）、JMD铰链区、酪氨酸激酶结构域1（TKD1）的β1片、残余TKD1区。大约70%的ITD插入位于JMD区域，而其余30%的非JMD区域的ITD插入大多位于TKD1的β1区域[14,15]，且有2个以上的ITD突变时，都位于JMD-Z区域的共同插入最多（41.5%）；都位于铰链区的共同插入最少（4.8%）[11]。在诱导治疗下，突变只位于JMD区域的患者应用米哚妥林有着更好的疗效[11]；与TKD1区域的突变相比，ITD突变于JMD区域的患者有着更高的CR率，同时这种反比关系在2个区域突变患者的AR和CR率也有着明显的体现[12]。JMD区域的ITD插入只有与NPM1突变共存时CR率才呈现显著的提高，TKD1区域内的NMP1插入则没有CR率改变。插入在JMD位置的ITD突变破坏了FLT结合位点的自我抑制结构，引起下游激酶持续激活[16]。值得关注的是，几乎所有含2个以上ITD突变的患者至少有1个JMD插入突变，且插入突变位于JMD-Z区的数量最多[15]，同时在2种以上的ITD共存时，位于主导地位的ITD突变的AR率是其他共插入突变AR率的2倍以上[11]。
在TKD1的β1片位点插入的ITD突变，表现出FLT3和STAT5的持续性磷酸化[11]，这说明非JMD区域结合的ITD使得FLT受体持续激活。在细胞实验中发现，非JMD区域的ITD突变细胞对FLT3抑制剂有耐药性，同时在小鼠转染模型中TKD1区域的ITD突变在米哚妥林和奎扎替尼的作用下具有比JMD区域更少的细胞凋亡现象[10]。因此有推论认为，非JMD区域的ITD突变可能会诱发TKD1区域的结构改变，产生新信号转导点，引起FLT3受体不同的信号转导，导致抗凋亡蛋白MCL1的上调[13]。
ITD的长度从三到几百个核苷酸不等，中位数一般为48个。研究发现，FLT3-ITD的长度、插入位点和AR率有密切关系，插入点的5'碳端越多，插入片段的长度就越长，同时AR率越高，ITD的长度越短，3'氮端越多，这可能是因为长的DNA片段在扩增方面存在不利因素[11,14]。插入位点位于TKD1的ITD大小远远大于插入JMD区域者，且1个以上的ITD插入更多见于TKD1区域[8]。
ITD的长度对临床预后的影响目前尚无定论，将ITD长度和插入位点合并为一个因素进行讨论可能更加有意义。Cucchi等[17]研究发现，与低AR组和ITD阴性组相比，AR>0.5的ITD突变组吉瑞替尼具有更高的FLT3靶向效应。此外ITD越长，吉瑞替尼的效应越好，而在高AR组中，不同ITD长度的患者对吉瑞替尼效应的影响差异无统计学意义。
动物实验研究显示，FLT3的持续激活引起骨髓增殖性肿瘤，但不足以导致AML发生[18]，而DNMT3A突变可能参与白血病的早期形成[19]，提示其极有可能是驱动基因。
Yang等[20]敲除FLT3-ITD突变小鼠模型中的DNMT3A基因，发现FLT3-ITD突变小鼠血液系统相关疾病进展加速，因而得出DNMT3A突变与FLT3-ITD突变在淋系及髓系白血病中有协同作用的结论。此外也有研究证实，在FLT3-ITD和DNMT3A突变的小鼠模型中可诱发AML[21,22]。
R882突变是典型的DNMT3A杂合突变，保留有约20%的野生型DNMT3A活性，不足以诱发疾病，而淋巴系疾病的产生需要更高的突变量[23]。髓系和淋巴系白血病可由造血干细胞内FLT3-ITD突变而产生，表明干细胞内的DNMT3A缺失导致白血病前状态，为ITD提供了第二次打击的基础。这种DNMT3A的缺失是可以逆转的，但是在基因组中重新表达DNMT3A并不能缓解白血病，表明DNMT3A缺失对于白血病的初始发生具有重要作用，但并不起维持作用[22,24]。ITD阳性的AML患者行allo-HSCT后半数以上可获得缓解，但复发率很高，生存时间较短，如果伴随DNMT3A基因突变，则诱导化疗的CR率显著降低。当DNMT3A单独突变时，并不能影响allo-HSCT患者的临床预后，但与FLT3-ITD联合突变时，OS不佳，RFS明显改善[25]。有研究发现，FLT3-ITD和DNMT3A双突变组比DNMT3A单突变组、FLT3-ITD单突变组以及二者均未突变组具有更高的白细胞计数以及髓系祖细胞比例；双突变组、DNMT3A单突变组中CD15+和HLA-DR+患者比例均比FLT3-ITD单突变组和无突变组高；而双突变组和FLT3-ITD单突变组中CD38+患者比例高于DNMT3A单突变组和无突变组。因而得出结论：DNMT3A和FLT3-ITD突变的比率可能与白细胞计数和髓系祖细胞增加、不良预后、低CR率、高复发率以及高死亡率有关[26]。
在一项临床研究中，104例NPM1突变的AML患者经过强化治疗达到完全分子学缓解，其中14例复发患者为野生型NPM1；初诊时，DNMT3A是所有患者最常见的伴随突变，更容易出现在后来伴有野生型NPM1复发的患者中，而复发时，ITD突变则在患者中占比更高[27]。体外实验表明，只有NPM1、FLT3和NPM1、NRAS突变混合的小鼠才出现高外显率的AML，且潜伏期短，提示FLT3和NRAS基因突变可能在NPM1驱动的白血病中作为第二次打击。在NPM1复发突变组中，FLT3-ITD极大地富集，表明这2个驱动基因突变在最初具有高侵袭力的克隆中具有引起复发的可能。
正如AML的发生不仅仅是某一个因素导致的一样，临床以及科研中也不能将某一个方面孤立来进行研究，但任何一个研究都存在自身不可避免的局限性和偶然性，导致我们只能尽力尝试去探究ITD突变背后庞大的致病机制。借助高通量测序、单细胞测序，积极探究ITD突变各个特性背后涉及的信号转导通路、伴随的突变基因、研究已发现的热点作用因子、靶向药物及allo-HSCT在不同ITD亚群中的疗效应该是未来研究的重要方向。
所有作者均声明不存在利益冲突
