异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前多种血液系统恶性疾病的唯一治愈方法，但其移植成功率受较多因素影响，如移植物抗宿主病(GVHD)、疾病复发及严重感染等。而移植物植入状态对GVHD和复发的早期预测和抢先干预尤为重要。嵌合状态分析作为检测allo-HSCT后移植物植入状态的常用方法，可及时、有效监测疾病状态，并且为后续治疗策略提供指导。笔者拟就嵌合状态分析方法及其作用、细胞谱系特异性嵌合状态分析，以及嵌合状态分析在非恶性疾病(NMD)中的应用等方面的研究现状进行阐述，旨在为提高allo-HSCT成功率提供参考。
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异基因造血干细胞移植(allogeneic-hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)中，供者造血干细胞植入是移植顺利的必要条件，而移植物植入状态的监测对判断移植是否成功至关重要。嵌合状态分析是allo-HSCT后移植物植入状态监测的常用方法，可以对植入是否成功、移植效果、疾病复发等提供参考信息，从而指导临床治疗。嵌合状态是指在受者接受allo-HSCT后，移植物中供者细胞植入受者体内，供、受者双方造血细胞达到共存的现象。其中，完全嵌合(complete chimerism, CC)指受者所有造血和淋巴细胞均来自异基因供者，而混合嵌合(mixed chimerism，MC)则被定义为受者与供者来源的造血或淋巴细胞同时存在。嵌合状态是动态演变过程，CC可演变为MC，这可能提示疾病复发；而MC亦可通过供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion, DLI)等方法提高嵌合率，并有可能达到CC。近期研究表明，相对于全血细胞嵌合状态分析，细胞谱系特异性嵌合状态分析对移植后复发预测更为敏感，作用更强[1]。笔者将对嵌合状态分析方法及其作用，细胞谱系特异性嵌合状态分析及嵌合状态分析在非恶性疾病(non-malignant disease, NMD)中的应用等方面的最新研究现状进行阐述。
目前，短串联重复序列(short randem repeat，STR)-PCR是allo-HSCT后最常用的嵌合状态分析方法，也常被作为检测嵌合状态的金标准[2]。STR是由1个重复单元中的2~7个碱基对组成的重复DNA序列。约3% STR出现在人类基因组中，并且主要位于非编码区。由于STR具有高度多态性、高突变率、操作简单和高重现性等优点，目前已被作为最常用的法医鉴定标志物[3]。相较其他检测方法，STR-PCR具有信息量较大的优势，但是其只是一种半定量检测方法，存在灵敏度较低(1%~5%)、PCR竞争及平台期结果偏倚的缺点，并且不同实验室间技术差异亦较大[4,5]。由于灵敏度较低可在一定程度上影响诊疗的及时性和准确性，所以选择高度特异性的STR等位基因位点十分重要。在嵌合状态分析中STR等位基因位点的大信息量代表其对受者细胞与供者细胞的区分提供一定保证[6]。研究指出，进行STR-PCR时，STR等位基因的选择与患者民族和移植类型有关[7]。此外，与无关供者allo-HSCT相比，亲缘供者allo-HSCT中用于进行嵌合状态分析需要的STR等位基因座的最小数量相对较多[8]。Chia等[9]选取13个等位等位基因座对253例接受造血干细胞移植的马来西亚患者进行嵌合状态分析结果显示，这13个等位基因座具有平衡的位点信息性、良好的准确性(R2＝0.996 8)和精密度(SD<2.49%)；相较于印度和中国人群，上述STR等位基因位点更适用于马来西亚人群的嵌合状态分析。由于STR-PCR是目前最常用的嵌合状态分析方法，探索更适合我国人群的STR等位基因位点可能对于我国患者接受allo-HSCT后嵌合状态监测大有益处。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多样性。SNP-PCR检测嵌合状态的灵敏度为0.01%~0.1%，并且信息量>90%[10]。研究显示，在发生复发前采用SNP-PCR进行嵌合状态分析对MC的检出时间，显著早于采用STR-PCR进行嵌合状态分析(30 d比120 d，P<0.007)，并且经SNP-PCR检出MC是预测患者复发的独立危险因素(RR＝6.08，P<0.000 1)[11]。费洋等[12]采用SNP-PCR检测105例接受allo-HSCT的急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者嵌合状态的研究结果显示，所有患者样本经SNP-PCR均可找到至少1个可区别的SNP位点(100%)，找到2个以上者为29例，并且allo-HSCT后90 d供者细胞嵌合率≤97.24%者的复发风险显著升高(HR＝6.921，95%CI：2.669~17.950，P<0.001)。这提示，SNP-PCR检测嵌合状态对复发有较好的预警作用。但Alizadeh等[13]研究结果显示，SNP-PCR检测嵌合状态虽有优越的灵敏度(<0.1%)，但是对于MC率>10%患者精确度较低。与STR-PCR相比，SNP-PCR应用于进行造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)后受者嵌合状态分析具有标准化、灵敏度高且信息量大的优势，但是其检测成本更高，因此临床应用存在局限性[14]。
二代测序(next generation sequencing, NGS)技术是基于PCR和基因芯片发展而来的高通量测序技术，可以对DNA或RNA样本的碱基对进行快速测序。Pettersson等[15]研究结果显示，采用NGS技术进行嵌合状态分析，可同时具有STR-PCR的高精确性和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)的高灵敏度。相对于STR技术，以SNP为基础的SNP-NGS技术具有更高的灵敏度，并且其可以克服STR检测过程中存在的不足，如影子峰、峰高不平衡、染色污染、电压增高等。SNP-NGS进行嵌合状态分析灵敏度可达0.01%~0.05%[16]。在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)患者中运用SNP-NGS技术同时监测嵌合状态和微小残留病(minimal residual disease, MRD)，可更好地反映MDS患者接受移植前、后临床病情变化，并为临床医师进行及时、有效的治疗选择提供指导依据[4,17]。但是，与微滴式数字PCR(digital droplet PCR, ddPCR)相比，NGS操作较为复杂，需要专业的生物信息学平台辅助，并且错误率相对较高[18]。尽管如此，目前采用NGS技术进行嵌合状态分析仍具有全基因、高通量、高灵敏度等突出优势，有望未来得到更多临床推广与应用。
DdPCR可广泛用于基因表达检测、克隆分析和热点突变筛查等方面，其检测嵌合状态的灵敏度<0.1%[19]。与NGS技术不同，ddPCR不能对全基因进行测序，但其将热点突变位点作为靶点时，具有更有效、便宜和省时的优点，目前该技术已经商业化，并且其检测等位基因突变率可达0.001%[20]。Mika等[21]采用ddPCR与STR-PCR检测源自10例患者的9份外周血和8份骨髓样本嵌合状态的研究结果显示，2种方法进行嵌合状态分析的结果具有显著相关性(骨髓样本：r＝0.989 9；外周血样本：r＝0.976 8；均P<0.000 1)；若将CC阈值定义为供者细胞数占受者骨髓或外周血细胞数的比例≥95%，则ddPCR与STR-PCR对CC和MC检测结果为100%相符，但是ddPCR比STR-PCR更为省时，操作亦更便利[19,21]。此外，相比RT-qPCR，ddPCR无须根据标准品进行校准，能准确地确定目标序列的绝对拷贝数[19]。ddPCR被证实同样适用于NMD，特别是适用于家族性疾病和具有复发突变的遗传性疾病患者的嵌合状态分析[22]。目前ddPCR使用仍具有局限性，其只能在每个样本中同时监测少数热点突变，仍有待进一步优化和提高。
随着技术的不断提高，嵌合状态分析方法亦不断发展。其中，STR-PCR已广泛应用于临床，NGS具有较高的灵敏度和准确度，ddPCR则在简便性方面显示出优越性。随着嵌合状态分析方法的不断发展完善，将更广泛地应用于allo-HSCT后疾病状态的预测与监测。
MC与急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease, aGVHD)发生风险较低有关，CD3+ T细胞MC提示aGVHD发生率降低[23,24]。一项纳入218例首次进行allo-HSCT患者的研究结果显示，在移植后1、3、6个月时，所有细胞系中高水平受者细胞与移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的发生具有相关关系(P<0.05)；移植1个月后，受者T细胞>50%患者(n＝23)较<50%者(n＝129)GVHD发生率显著升高(43.5%比5.4%，P<0.001) [23]。嵌合状态可以预测GVHD，而GVHD的发生亦可以反向对嵌合状态进行提示。El-Cheikh等[24]对115例接受allo-HSCT患者的研究结果显示，81%(93/115)患者在移植后平均77 d(30~120 d)实现CC；移植后120 d时，发生≥2级aGVHD患者(n＝37)均获得供者CD3+T细胞CC(100%)，而未发生≥2级aGVHD者(n＝78)CC率为73.1% ，二者比较，差异有统计学意义(P＝0.002)。该结果提示，aGVHD对供者T细胞CC有提示作用，而aGVHD发生后是否应频繁进行嵌合状态分析目前尚存争议。
MC与接受allo-HSCT患者移植后复发有关。Reshef等[25]对121例接受减低剂量预处理(reduced-intensity conditioning, RIC)-HSCT的血液系统恶性疾病患者的研究结果显示，移植后30 d时全血细胞嵌合水平与患者复发减少显著相关(HR＝0.90，95%CI：0.86~0.94，P<0.001)[25]。在未发生慢性GVHD(chronic GVHD, cGVHD)患者中，供者T细胞嵌合率<97%患者(n＝15)的复发率显著高于T细胞嵌合率≥97%者(n＝16)，差异有统计学意义(66.7%比25%，P＝0.03)，并且T细胞MC是复发率增高的独立危险因素(HR＝2.48, 95%CI：1.03~5.96，P＝0.04)[26]。这提示，供者T细胞嵌合对未发生cGVHD患者的复发有预测价值。一项纳入261例allo-HSCT患者的研究结果显示，移植后3个月时CD34+骨髓干细胞嵌合是预测髓系肿瘤患者移植后复发的可靠标志物(CC阈值定义为供者细胞数占受者骨髓细胞数的比例≥90%)，并且其相对于外周血的优势为骨髓中可分选出更多数量的CD34+细胞，从而达到更好的检测灵敏度[27]。但是这项研究对象主要为髓系肿瘤患者，该结论对于其他血液系统恶性疾病患者是否适用，仍需要进一步验证。此外，虽然现有研究结果显示T细胞嵌合在预测aGVHD和复发上均较全血细胞嵌合效果好[23,26]，但是T细胞嵌合是否可以取代全血细胞嵌合进行嵌合状态分析以预测移植后复发，仍需进一步探索。
Allo-HSCT后，与未分类细胞相比，按细胞谱系进行嵌合状态分析可以更敏感地检测残留或复发的白血病细胞[28]。在急性白血病中，可以通过流式细胞术分选出可疑细胞群，再进行细胞谱系嵌合状态分析，可以提高检测特异度[1]。目前用于进行特异性嵌合状态分析的常见细胞谱系为CD33和CD34、CD3、B细胞和自然杀伤(natural killer，NK)细胞。
AML具有遗传异质性，既往未能发现该病的特异性MRD标志物。一项研究结果显示，CD34+细胞嵌合状态分析可应用于监测AML患者的MRD，而对于CD34—者，CD117+细胞嵌合状态分析可能是其可行的替代方案之一[28]。Lindahlde等[29]研究结果显示，早期CC(阈值定义为allo-HSCT后60 d内外周血或骨髓样本中CD33+细胞受者DNA比例<0.2%)与AML患者移植后复发呈负相关关系(P＝0.033)。上述结果提示，CD33和CD34细胞谱系特异性嵌合状态分析可以监测疾病复发，从而指导临床尽早进行治疗。
高灵敏度的细胞谱系特异性嵌合状态分析可通过监测CD3+骨髓细胞嵌合预测急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者的移植后早期复发。Lindahl等[30]对138例AML成年患者的研究结果显示，复发前至少30 d采样的CD3+骨髓细胞中受者嵌合度的增加与移植后复发有关，其预测复发的灵敏度为73%，特异度为83%。Tan等[32]对93例接受allo-HSCT的多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)患者的研究结果显示，移植后30、90 d的CD3+细胞CC与aGVHD(d 30：HR＝3.29 ，95%CI：1.94~87, P<0.001；d 90：HR＝3.24，95%CI：1.36~5.61，P＝0.006)和广泛性cGVHD(d 90：HR＝2.04，95%CI：1.02~3.58，P＝ 0.04)的发生风险增加相关，但是CD3+细胞嵌合状态分析较流式细胞术检测MRD对复发的预测灵敏度低(3个月：40.0%比63.2%；6个月：21.4%比83.3%；≥9个月：0比70.6%)，这提示其对复发的预测价值有限。Guidotti等[33]对142例接受allo-HSCT成年患者的研究结果亦显示，移植后30 d时CD3+细胞MC对疾病复发无显著影响(P＝0.448)，究其原因，可能是由于疾病类型、预处理方案、移植物来源、检测时间存在差异所致。
骨髓B细胞谱系嵌合状态分析可用于预测急性B淋巴细胞白血病(B cell ALL，B-ALL)患者的血液学复发，并且其检测灵敏度高于T细胞和NK细胞。Jiang等[34]对153例接受allo-HSCT患者的研究结果显示，采用B细胞和NK细胞进行嵌合状态分析，33例患者(33/153，21.6%)出现疾病复发。供者嵌合率下降对患者移植后发生血液学复发和孤立性髓外复发的阳性预测值分别为58.8%和10%(P＝0.018)。有研究对3例接受allo-HSCT的非B-ALL患者进行谱系特异性嵌合状态分析结果显示，复发后患者外周血NK细胞嵌合率较B细胞嵌合率下降更为明显(54%比81.7%)[35]，这提示NK细胞嵌合率的降低可能与非B-ALL患者的复发有关。另有研究表明，较高的NK细胞嵌合率与较低的复发风险具有显著相关关系(P＝0.000 9)，并且这种关系不受供者类型或疾病类别的影响，与aGVHD的发生无关(P＝0.38)[36]。这表明，在HSCT后早期进行NK细胞过继免疫治疗促进NK细胞嵌合，可能成为提高患者预后的有效方法。
MC最初于NMD患者(特别是免疫缺陷疾病患者)中被发现，再生障碍性贫血患者接受HSCT后中亦可发现MC[37]。研究结果显示，与肿瘤患者相比，NMD患者接受HSCT后更容易观察到MC现象，低危患者亦较高危患者MC发生率更高[38,39,40]。究其原因，可能是由于大部分NMD患者未接受化疗或仅接受RIC，使其免疫功能常正常或仅轻微降低，足以发挥对供者移植物的排斥作用，导致MC，而暴露于多周期的骨髓抑制化疗则会增加受者造血细胞和T细胞对移植前清髓和非清髓性预处理方案的灵敏度，因此MC现象少见[38,41]。在NMD患者中，MC的存在并不等同于移植后疾病复发或继发性移植失败[10]，而CC在NMD患者中并非必须条件，若细胞谱系特异性植入即可提示治愈或抑制疾病[40,42]。在NMD中，存在长期、稳定MC的患者常健康状况良好，并且在免疫学上可达到与CC患者相似效果，并且稳定MC与cGVHD风险降低相关，对于该类患者，若MC持续保持稳定且未发生疾病进展，可能不推荐在GVHD高风险情况下接受DLI治疗[43]。但是亦有研究发现，CC和高水平MC患者的5年总体生存(overall survival, OS)率分别为84.7%和89.9%，显著高于低水平MC和自体恢复患者的64.2%和71.7%(P<0.001)[41]。目前在NMD患者中，达实现疾病控制的供者嵌合率标准差异较大，为10%~90%[42]，并且是否需要在NMD患者中提高该嵌合率标准，仍尚存争议。因此，根据不同疾病类型选择合适的疾病控制嵌合率标准，可能是未来的研究方向，并且提高嵌合率标准的同时，还应考虑随之增高的GVHD发生风险。目前在56例NMD患儿可以观察到CD34+细胞输注数量与移植后14 d供者嵌合率呈正相关关系(r ＝ 0.302，P ＝ 0.027)[44]。对于NMD，选择性CD34+干细胞输注可以促进HSCT后MC，约1/3患者可能受益于选择性CD34+干细胞富集，并可避免第2次HSCT；与DLI相比，该方法无发生GVHD的不良影响，并且早期治疗可减少感染并发症发生风险，提高患者生存率[39,45]。总之对于NMD患者，CC并非必需条件，但仍需要注意根据不同疾病类型维持不同标准的嵌合状态。
嵌合状态分析在allo-HSCT中的地位举足轻重，对于复发和GVHD的早期发现和干预有着十分重要的意义，层出不穷的检测手段不断提高着嵌合状态分析的灵敏度和精确度。嵌合状态评估不再局限于对全血细胞相关研究，而逐渐开始深入不同的细胞谱系，从而可以更灵敏地检测肿瘤细胞残留，并对移植疗效评定及疾病预后预测等发挥更突出优势。此外，达到CC并非NMD治疗的必需条件，一味追求高嵌合率并不能使该类患者临床获益，而持续稳定MC也可以使其获得良好预后。最后，随着科技的不断发展和临床研究的持续深入，嵌合状态分析在接受allo-HSCT患者移植后的治疗及预后判断等方面有望获得更广泛、系统和精准的应用。
所有作者声明无利益冲突
