宫颈癌是全球女性中排名第4位的常见癌症，严重威胁女性健康^［1］。高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）持续感染被认为是宫颈癌发病最主要的病因^［2］。因此，HPV分型检测已成为宫颈癌前病变筛查和预防宫颈癌的临床常规手段。

HPV基因组长度约为8 000 bp，分为早期基因区（E）、晚期基因区（L）和非编码区（URR）3个主要区域。HPV病毒基因组整合到人体基因组被认为是HPV持续感染的分子基础，也是促宫颈癌的关键步骤。病毒基因整合后表达E6和E7蛋白，二者分别通过降解抑癌蛋白p53和视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）使得宿主细胞基因组不稳定、周期调控紊乱，影响细胞增殖和干扰素应答，促进免疫逃逸^{［3, 4］}。研究表明，p53基因有一个功能性突变（rs1042522，p.Arg72Pro），携带p53（p.72Arg）的个体罹患宫颈癌的风险显著增加^{［5, 6］}。同样，编码pRb的RB1基因也有一个功能性突变（rs3092905，p.Glu746Gly），突变型pRb与转录因子E2F的结合亲和力明显降低^［7］，更容易导致肿瘤的发生。因此，HPV感染和p53、RB1基因的突变协同促进宫颈癌的发生发展，若将HPV筛查与p53和RB1基因型的鉴定相结合，则可大大提升宫颈癌及其癌前病变风险评估的准确性。

目前，已有直接杂交法、信号放大法、靶向扩增法等方法用于高危型HPV的分型诊断，但都存在灵敏度低、通量小、操作过程复杂等问题^［8］。本团队一直致力于闭管高通量 PCR技术的研发。在前期碱基猝灭探针技术^［9］的基础上研发了高通量闭管多重二维PCR（two-dimensional PCR，2D-PCR）技术^［10］。本研究在前期应用2D-PCR法单管分型9种HR-HPV的基础上进行了优化和创新，建立了一种可以单管同时检测16种高危型HPV和p53、RB1基因突变的方法，不仅极大地增加了检测通量，而且增加了相关肿瘤抑制基因分型的鉴定，为临床更有效、更特异的筛查宫颈病变提供了更加可靠的技术手段。

HPV检测作为宫颈癌及癌前病变的初筛手段，目前主要检测方法包括杂交捕获法、荧光原位杂交法、芯片技术杂交法、实时PCR法和斑点印迹法等^［11］。这些方法在不同程度上存在操作繁琐、成本昂贵、易污染、耗时长、特异性及灵敏度低等问题。p53和RB1基因分型检测通常采用限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism analysis，RFLP）或TaqMan探针的方法，也存在操作繁琐或检测通量严重不足等缺点^{［12, 13］}。因此，本研究基于2D-PCR的原理，建立了一种能在单管内同时检测16种HR-HPV、并准确鉴定p53和RB1基因型的方法。该方法既是对前期已发表技术的优化和创新，同时也在大规模临床样本中得到进一步验证。技术的优化和创新体现在：（1）对高危型HPV的检测从之前的单管检测9种提升到了16种，提高了检测通量；（2）本研究在2D-PCR原理的基础上结合ARMS-PCR引物设计原则，在检测HPV的同时纳入相关肿瘤抑制基因p53和RB1的鉴定；（3）待测靶基因p53及RB1基因还可以作为评判标本取样及PCR扩增成功与否的内参基因。本研究用这一优化创新过的技术验证了804份临床样本，并且与现有的检测方法如PCR-反向点杂交法、流式荧光杂交法、单重实时荧光定量PCR法分别进行了一致性比较，并对其准确性进行了研究。

根据2D-PCR技术的原理^［10］，正向引物5′端连接了不同的标签序列，使得引物的长度和复杂性都相应增加，容易形成二聚体或发夹结构，影响其与模板的结合效率。因此，不匹配碱基的位置和类型、Mg²⁺浓度、酶的活性和浓度、退火温度都需要一步步优化^［14］。方法学建立后，对来自门诊的804份宫颈刷样本进行了16种HR-HPV的分型和p53、RB1基因型的鉴定。结果表明，该方法能成功鉴别16种HR-HPV和p53、RB1基因型。尤其是2D-PCR基因分型结果与Sanger测序结果完全一致，显示出较高的准确性。

2D-PCR法与流式荧光杂交法的总体一致性（0.793）要高于反向点杂交法（0.699），究其原因，可能和宫颈刷样本的核酸提取方式相关。反向杂交法中通过直接煮沸法裂解细胞，裂解液上清直接用于后续PCR检测。上清中DNA纯度和浓度较低，且可能含有RNA、蛋白质等杂质的干扰，对检测的灵敏度影响较大^［15］。流式荧光杂交法则是采用树脂离子交换吸附法提取脱落细胞沉渣中的DNA，树脂一方面可以吸附Mg²⁺使DNA酶失去活性，避免DNA被降解，另一方面还可吸附杂蛋白以及其他类型2价重金属离子从而提高DNA的纯度^［16］。因此，推测流式荧光杂交法提取的DNA质量优于反向点杂交法，更适合2D-PCR法后续的扩增及检测。由于反向点杂交法、流式荧光杂交法和2D-PCR法都是基于多重PCR原理，引物间的相互干扰一定程度上影响了反应的敏感性和特异性，因此理论上来说，这3种方法的准确性都要低于单重实时荧光定量PCR法。因此，针对每一种HR-HPV设计了特异引物和探针进行单重PCR扩增，结果显示2D-PCR法和单重实时荧光定量PCR法之间具有高度的一致性，Kappa=0.880，说明2D-PCR法具有较高的准确性。另外，由于HPV病毒型别众多且基因组经常发生高频突变，在引物设计过程中要找到完全特异序列较为困难，不同检测方法中引物的特异度也影响着方法学的准确性。最后，反向点杂交法和流式荧光杂交法在检测过程中都需要对PCR产物开盖取样进行杂交等操作，极易造成产物的污染从而导致出现假阳性结果。

p53基因编码的p53蛋白在调节细胞周期、细胞凋亡、基因组稳定性等方面发挥着关键作用，是最广泛研究的肿瘤抑制基因之一。研究表明，p53 rs1042522多态性（p.Arg72Pro）与多种肿瘤相关，如宫颈癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌和食管癌等^{［17, 18, 19, 20, 21］}。该多态性的突变可导致p53蛋白氨基酸发生改变，从而影响其功能，如诱导DNA修复或促进细胞凋亡的能力。然而，这种突变与患癌风险和预后的相关性在不同肿瘤类型和人群中存在差异。在宫颈癌等其他HPV相关癌症中，p53 rs1042522突变导致的氨基酸改变与HPV感染相关，与HPV E6/E7 mRNA表达相关^{［22, 23］}。本研究检测的804份临床样本中，p53 G/G型 258份（32.09%）、G/C型 401份（49.88%）和C/C型 145份（18.03%），基因型分布频率与之前的研究报道一致^［24］。RB1基因编码的pRb蛋白是细胞周期的关键调控者，其突变与多种肿瘤如视网膜母细胞瘤、骨肉瘤和小细胞肺癌等相关。HPV E7蛋白与pRb蛋白结合后，导致pRb蛋白降解并释放与其结合的转录因子E2F，从而激活参与G1/S期调控的细胞周期调控基因，导致细胞的无限增殖^［7］。因此，RB1基因突变和HR-HPV感染都与宫颈癌相关。但本研究中并未筛查到RB1 rs3092905（p.Glu746Gly）的突变，这可能与地区、人种相关。本研究将2个肿瘤相关抑制基因和16种HR-HPV型别的联合检测，对高级别宫颈病变的风险评估及临床筛查、诊疗具有重要的意义。

尽管2D-PCR法检测HR-HPV型别和基因型的敏感性分别可为10²拷贝/μl和10³拷贝/μl，但这并不影响临床样本的结果判断。事实上，在标准的宫颈刷采样流程中，通常能收集到数千至上万个脱落细胞，提取到的DNA浓度远超过10³拷贝/μl，足以满足2D-PCR法最低检测要求。因此，本研究所建立的研究方法中，以待测靶基因p53及RB1同时作为内参基因的设计，不仅确保了个性化诊疗的可靠性，还避免了由于样本质量不合格而引起的假阴性结果，从而提高了诊断的准确率。2D-PCR方法是一种革新性的技术，它克服了传统HPV检测和基因分型检测方法存在的一些限制。该技术通过在单个反应管中同时进行多种HPV类型和基因的检测，从而实现快速、准确分型，提高了诊断效率，减少了患者的等待时间。

此外，课题组还应用2D-PCR技术成功建立了单管鉴别耳聋相关基因 9个突变位点27种基因型^［25］、ABO血型分子分型^［26］、卡马西平不良反应相关基因 HLA-B*15∶02^［14］、心律失常相关基因^［27］的鉴定方法。其他研究机构也应用2D-PCR技术开发了单管鉴定多种疟原虫^［28］，单管筛查耐药相关整合子^［29］，单管筛查引起尖锐湿疣的5种HPV亚型^［30］、单管检测4种肠道微生物等的方法^［31］。2D-PCR技术的开发为快速、准确的单管多靶基因检测提供了新的解决方案，为精准医疗和个体化治疗提供了强有力的技术支持，具有广泛的应用价值。

后续研究将进一步扩大临床样本量，将临床病理诊断和2D-PCR法测得的HR-HPV型别、p53和RB1基因型结果相结合，应用多基因风险评分公式计算个体罹患高级别宫颈病变的风险得分，探索其是否可以作为宫颈癌的风险预测的辅助工具。2D-PCR方法的建立大幅缩短HR-HPV型别鉴定和相关肿瘤抑制基因分型的时间，降低了宫颈癌筛查的经济成本，具有许多传统方法所不具备的优点，有望成为未来宫颈癌及其癌前病变筛查和基因分型的重要工具。然而，这种方法应用于临床实践还需通过大规模临床试验来验证其准确性和可靠性。