细胞外囊泡是一种来源于内体和细胞膜的多样化的膜性囊泡，在细胞间通讯中发挥关键作用。严格的生物发生途径赋予细胞外囊泡广泛的来源和特殊的亲本特性，复杂的内容物及表面蛋白有利于受体细胞的识别。细胞外囊泡依靠天然的生物相容性和囊泡结构来容纳更多的功能生物分子，是一种极具潜力的药物递送载体。主要介绍了细胞外囊泡的分类及生物学功能、在不同类型药物递送中的特点，讨论了细胞外囊泡在疾病治疗中的应用以及细胞外囊泡递送系统的临床转化和挑战。
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细胞间通讯是协调细胞运作和有效发挥其功能的关键。细胞通过产生胞外信号与靶细胞表面的受体结合，激活受体并建立细胞内信号转导通路。而细胞信号转导涉及多种内容物的释放，能够调节临近的其他细胞[1]。其中，细胞外囊泡作为载体，将蛋白质、脂质和遗传物质运输到受体细胞，则是一种特殊的细胞间通讯方式。利用细胞外囊泡介导生理和病理过程的能力可以设计药物靶向特定的目标。
细胞外囊泡是细胞来源的膜质颗粒的统称，由脂质体、表面蛋白及膜蛋白混合组装而成，包括干细胞[2]、免疫和神经系统的原代细胞[3]以及癌细胞[4]。细胞外囊泡几乎已经能从所有的哺乳动物细胞中纯化出来，因此，其在体内器官中几乎无长期累积，没有全身毒性。近年来，细胞外囊泡凭借高生物相容性及特殊表面蛋白的靶向行为，成为药物靶向递送的研究热点。
目前，金属纳米粒子、聚合物纳米粒子、碳基纳米粒子和脂质纳米粒子在药物控释和递送方面显示出巨大的潜力[5,6]，能够有效改善难溶性药物溶解性差、稳定性低及生物利用度低的现状。但合成材料可能引起的细胞毒性和低生物相容性极大地限制了以上诸多纳米药物递送系统的发展[7]。细胞外囊泡由于具有天然的生物相容性、循环稳定性及无免疫原性等诸多优势，逐渐成为设计药物靶向递送的理想候选者。本文主要介绍了细胞外囊泡的分类及生物学功能、在不同类型药物递送中的特点，讨论了细胞外囊泡在疾病治疗中的应用以及细胞外囊泡递送系统的临床转化和挑战。
细胞外囊泡是通过3种不同的生物发生途径产生的，主要包括外泌体、微泡和凋亡小体。外泌体是通过内体途径产生的，直径为50～150 nm[8]。微泡则是直接通过质膜向外挤压而产生的，直径为100～1 000 nm[9]。凋亡小体是通过细胞程序性死亡途径产生的最大细胞外囊泡，拥有丰富的细胞内容物，直径为50～5 000 nm[10]。凋亡小体表达小窝蛋白-1（caveolin-1，CAV-1）、细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）及"吃我"信号分子，易被巨噬细胞迅速清除。而外泌体和微泡可以通过脂筏形成、小窝或网格蛋白内吞作用以及受体介导的信号转导等多种机制内化。内化的细胞外囊泡，能够在生理状态下释放腔内容物，在细胞通讯间发挥重要作用，从而达到靶向递药的目的。
源自内体途径的外泌体是通过晚期内涵体膜向内挤压形成多泡体，再由多泡体腔内出芽后与细胞膜融合释放到细胞外而形成的。涉及运输所需的内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）蛋白是外泌体生物发生中的关键蛋白，主要包括ESCRT-0（肝细胞受体酪氨酸激酶底物）、ESCRT-Ⅰ（肿瘤易感基因101）、ESCRT-Ⅱ（膜泡蛋白分选关联蛋白25）以及ESCRT-Ⅲ（染色质修饰蛋白4A）等，共同参与货物分选并在晚期内体膜内陷中发挥特殊作用[11]。ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ负责识别泛素化的货物，并将其分选入核内体管腔中[12]。ESCRT-Ⅱ负责激活ESCRT-Ⅲ的组装，而ESCRT-Ⅲ参与招募辅助蛋白，共同参与多泡体和腔内囊泡的形成。此外，在非ESCRT途径中，外泌体富含蛋白质、脂质和核酸等，这些相对稳定的组分赋予外泌体对相邻或远端细胞的细胞通讯及生物学效应。外泌体可以通过鞘磷脂酶水解形成神经酰胺介导多泡体腔内出芽形成囊泡并释放到细胞外[13]。同时，外泌体表面存在大量蛋白，在膜内陷和药物结合中发挥关键作用。如外泌体表面高表达CD47，能够避免单核吞噬细胞系统的免疫清除，延长血液循环时间。CD47可以与其先天免疫细胞上的受体信号调节蛋白α相互作用，激活"不要吃我"信号[14]。由于这些特征，外泌体作为药物递送的潜在平台引起了相当多的关注。
微泡是细胞激活或损伤后细胞膜脱落的小囊泡。据报道，膜的出芽发生在质膜的特定位置，并受到磷脂的再分布和肌球蛋白轻链磷酸化和收缩机制的影响[15]。不同来源的微泡之间具有共同的生化特征，如表面标记的CD40配体、整合素以及膜中富集的磷脂酰丝氨酸等[16]。尽管膜的出芽机制尚未完全阐明，但微泡可以赋予细胞间通讯更多的可能性。Hou等[9]将正常肝细胞、肝癌外泌体及微泡分别与单核细胞共孵育进行对比，发现肝癌细胞微泡能向单核细胞传递丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2），激活单核巨噬细胞分化的关键转录因子早期反应生长因子-1（early growth response fator-1，Egr-1）和MafB的转录。如微泡释放的PKM2可以诱导糖酵解代谢重编程，促进MafB启动子区域组蛋白乙酰化，上调转录因子的表达。微泡介导细胞间通讯作用为靶向癌症治疗提供了新策略。
与外泌体和微泡不同的是，凋亡小体产生于细胞凋亡的最后阶段。当生理或病理信号触发程序性细胞死亡时，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）介导细胞膜起泡，并激活泛连接蛋白1通道和囊泡运输形成凋亡突起（包括微管尖峰、凋亡伪足和珠状凋亡伪足），这些突起最终通过Caspase辅助裂解释放凋亡小体[17]。凋亡小体具有母细胞来源的丰富细胞器、蛋白质、核酸、脂质和其他凋亡相关分子，与细胞间通讯作用密切相关。凋亡小体可以作为核酸的转运体，介导基因在细胞间的传递。相较于其他细胞外囊泡的亚型，凋亡小体具有最高含量的微小RNA（microRNA，miRNA）[18]。miRNA是一种参与多种生理或病理状态的功能分子，具有独特的细胞间"穿梭"能力，能够调节受体细胞的活性[19]。此外，凋亡小体膜特有的信号分子可以促进受体细胞对凋亡小体的特异性识别和摄取，实现细胞间蛋白质的转运。如在2型糖尿病中，间充质干细胞凋亡小体富含血管舒张刺激磷蛋白、晶状体蛋白αβ和环腺苷酸依赖性蛋白激酶Ⅱ-α亚基等，能够诱导巨噬细胞向M1型极化[20]。凋亡小体强大的负载能力和广泛的靶向范围为设计新型药物递送载体提供了新的思路。
细胞外囊泡在体内任何组织和器官均没有长时间积累，几乎无全身毒性。细胞外囊泡由于具有天然的生物相容性、循环稳定性及无免疫原性等诸多优势，已被视作最具潜力的新型药物递送载体。
细胞外囊泡的固有特性使其介导的递送系统能够增加药物在肿瘤部位的富集，并同时降低毒性和耐药性。Morrison等[21]利用乳腺癌细胞外泌体负载阿霉素，提高了阿霉素的稳定性，实现了阿霉素在病灶部位的蓄积。结果表明，该策略能够在降低心脏毒性的同时显著增强阿霉素的肿瘤靶向性。Li等[22]将紫杉醇负载到肿瘤靶向肽修饰的胚胎干细胞外泌体中，显著抑制了胶质瘤小鼠模型中小鼠的肿瘤生长。
细胞外囊泡具有调节免疫机制的能力。通过蛋白质组学分析，在抗原提呈细胞吞噬的细胞外囊泡中鉴定出了多种特异性免疫蛋白。如在内皮细胞的凋亡小体中发现了白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1），能够上调健康的内皮细胞中IL-8的表达，从而诱导中性粒细胞浸润小鼠腹膜[23]。同时，作为细胞间信息传递的载体，细胞外囊泡肩负着递送生物信息分子的职能，可以避免蛋白多肽类大分子药物在体内被降解失活，完成细胞间的蛋白质转运。Ganesan等[24]将脂质过氧化物和蛋白质加合物封装在稳定转染细胞色素的肝癌Huh7.5细胞凋亡小体中，实现从肝实质细胞到非实质细胞和肝星状细胞的转运，上调了肝脏炎症基因和纤维化基因的表达。Saari等[25]利用携带表皮生长因子的外泌体负载抗体-药物偶联物恩美曲妥珠单抗，成功将细胞毒性药物递送到乳腺癌细胞中，显著抑制了癌细胞增殖。
基于细胞外囊泡的治疗技术近年来得到了广泛的关注和研究，并表现出巨大的临床转化潜力。如间充质干细胞来源的细胞外囊泡因其特殊免疫调节潜力，已被用于心肌缺血/再灌注、卒中和乳腺癌等多种疾病模型[29,30]；树突状细胞衍生的细胞外囊泡可用于多种传染病（包括结核病、弓形虫感染等）预防疫苗的接种[31]。细胞外囊泡本身是一种优异的纳米递送载体，可以进行工程化改造，通过治疗因子负载、表面修饰等方式进而用于疾病治疗。近年来，外泌体相关疾病研究最多的领域是抗肿瘤免疫[32]。
免疫治疗一直以来是癌症治疗的热点话题。其中，抗程序性死亡受体-1（anti-programmed death-1，αPD-1）/程序性死亡-配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）[33]、抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（anti-cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，αCTLA-4）[34]和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）[35]等策略备受关注。研究表明，αPD-1/PD-L1介导的抗肿瘤反应取决于识别和杀死肿瘤细胞T细胞的浸润程度[36]。肿瘤组织中，由于不具炎症表型的"冷瘤"往往缺乏CD8+ T细胞的浸润，αPD-1疗法对大多数癌症的疗效有限。同时实体瘤中致密的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）阻碍了CAR-T细胞的富集，仅通过CAR-T疗法难以克服药物在实体瘤中难以渗透的瓶颈[37]。如何重建肿瘤微环境并将药物精准递送到靶部位产生作用依然值得摸索。利用细胞外囊泡载体源自母细胞独特的表面蛋白表达，使其拥有对肿瘤微环境的特异性靶向能力或利用微环境中富集的免疫细胞作为中间体介导纳米粒在病灶富集的靶向递药策略逐渐进入人们的视野。不同母细胞来源的细胞外囊泡携带丰富的活性物质，包括miRNA、DNA、蛋白质和脂质。这些"特定的条形码"赋予其独特的肿瘤归巢靶向能力、免疫刺激能力、ECM降解能力和细胞识别能力，为提高抗肿瘤免疫治疗和迎接抗肿瘤免疫周期性挑战提供了策略。
在过去的几年里，细胞外囊泡介导的药物递送系统一直是肿瘤免疫研究的焦点。据报道，CAR-T细胞来源的细胞外囊泡能够表达高水平的穿孔素、颗粒酶以及嵌合抗原受体，诱导其同源抗原的肿瘤细胞死亡。尽管CAR-T疗法受到CAR-T细胞肿瘤渗透性差的限制，但CAR-T细胞外囊泡拥有跨越生物屏障的小体积，可以有效穿透实体瘤。Johnson等[38]让内源性非编码RNA-RN7SL1在CAR-T细胞高水平表达，通过模式识别受体视黄酸诱导型基因Ⅰ和黑色素瘤分化相关蛋白5激活信号传导，有效地激发了CAR-T细胞的活性。Pan等[33]利用多肽修饰的细菌外膜囊泡负载含有PD-1质粒，实现了PD-L1在肿瘤细胞中的自阻断。该纳米载体利用囊泡的高生物相容性和靶向能力，将PD-1质粒成功递送到细胞核，最终诱导肿瘤细胞表达PD-1。该策略对肿瘤的治疗效果提升显著，为肿瘤免疫治疗药物的开发提供了新的思路。
死亡肿瘤细胞释放足够的肿瘤抗原是抗肿瘤免疫反应的基础[39]。化疗是目前最常用的癌症治疗手段之一，其能够产生大量的肿瘤抗原，诱导免疫原性细胞死亡，进而诱发抗肿瘤免疫[40]。然而，单一的化疗难以扭转靶向递送效率差和细胞毒性低的局面。因此，迫切需要开发新的联合替代疗法。
肿瘤细胞来源的细胞外囊泡天然富含肿瘤抗原，具备固有的肿瘤归巢特性，是理想的抗癌载体。Ran等[41]开发了负载化疗药物的肿瘤细胞源性微泡。这种包封化的微泡能够有效地抑制化疗药物的外排，将其精准递送至肿瘤细胞，从而逆转耐药性并有效杀死肿瘤干细胞。同时，该体系优异的抗肿瘤疗效在荷瘤小鼠模型和恶性胸膜积液肿瘤患者中均得到证实。
近年来，光热疗法作为一种新的癌症疗法受到广泛关注。光热疗法不仅可以利用近红外激光照射光热剂产生热疗来消融肿瘤细胞，还可用于有效控制药物的释放。据报道，光热疗法联合免疫治疗比单一的光热疗法或免疫治疗更有效。光热疗法可以诱导免疫原性细胞死亡，并伴有损伤相关分子模式，可以改善癌症免疫循环。Cheng等[42]将基因工程化外泌体和载药的热敏脂质体相结合而设计了一种混合治疗型纳米囊泡。该纳米囊泡不仅通过同源靶向增强药物在肿瘤部位的积累，而且可以通过激光照射导致免疫原性细胞死亡以产生大量的肿瘤相关抗原，引发强烈的免疫反应。
细胞外囊泡因来源广泛、结构稳定和内容物丰富在细胞间信息与物质传递中扮演重要角色，被认为是极具潜力的药物递送载体。据报道，细胞外囊泡也在越来越多的疾病领域得到运用，如神经退行性疾病和心血管疾病等。Alvarez-Erviti等[43]构建了编码溶酶体相关膜蛋白2B（lysosomal-associated membrane protein 2B，LAMP2B）的质粒并将其转染到树突状细胞中，获得的外泌体通过膜上的LAMP2B与神经元特异性狂犬病病毒糖蛋白肽融合，可以有效地将小干扰RNA递送到小鼠大脑。此外，研究表明富含miR-133b的间充质干细胞外泌体提高了体外神经突向外生长的水平[44]，表明载有miRNA的外泌体治疗脑卒中可以促进脑重塑。此外，细胞外囊泡可作为心血管疾病的独立疗法。Wang等[45]利用LAMP2B与CSTSMLKAC融合的慢病毒对外泌体进行基因修饰，可以靶向缺血心肌细胞。另外，Zhu等[46]将CSTSMLKAC修饰的外泌体注射到心肌梗死的小鼠身上，可使左心室射血分数增加46%。由此可见，细胞外囊泡是保护心脏免受缺血损伤以及促血管生成的理想治疗剂。
越来越多细胞外囊泡的相关疗法应用于临床试验，目前已有超过100项的相关试验成功注册，包括用细胞外囊泡进行液体活检、探索细胞外囊泡作为治疗剂的潜力等。据报道，细胞外囊泡的给药途径包括全身注射、吸入和局部涂抹等多种形式。细胞外囊泡作为治疗剂的研究包括治疗癌症、炎症、神经退行性疾病、卒中后修复以及严重呼吸综合征冠状病毒-2感染等。
细胞外囊泡是药物开发和递送的理想候选者，但细胞外囊泡递送系统的临床转化仍障碍重重。如何稳定大规模生产临床细胞外囊泡制剂是当下研究的重点。而严格控制供体细胞的选择维持其遗传稳定性是其中的关键。研究表明，抗体生产技术和细胞治疗技术的进步已经能够实现不锈钢生物反应器培养大规模的细胞外囊泡[47]。其中，间充质干细胞和胚胎心肌细胞能够在细胞扩大培养中稳定细胞表型，使得大规模体外培养稳定来源的细胞外囊泡成为可能[48]。接下来，需对细胞外囊泡进行分离和纯化，常用的细胞外囊泡分离方法包括切向分流、离心、沉淀、尺寸排阻层析和亲和色谱等。迄今为止尚未提出分离大规模细胞外囊泡的最佳方法。常见的临床试验中，往往将切向分流作为分离和浓缩步骤富集细胞外囊泡，然后再通过超速离心进一步纯化分离[49]。尽管密度梯度离心和差速离心可以实现高纯度细胞外囊泡的分离提取，但仍存在低通量和难以放大的缺点，难以应用在大规模细胞外囊泡的分离中。因此，分离纯化方法的选择需要综合考虑对细胞外囊泡纯度的具体要求，折中选择产物的纯度和产量。
临床研究表明，纯化后的细胞外囊泡需要储存在−80 ℃，不同储存温度会对细胞外囊泡的粒径、蛋白质量造成一定的影响。目前临床试验已实现生理盐水、磷酸缓冲盐溶液及细胞培养基在细胞外囊泡储存和纯化中的应用。并且研究证实，添加海藻糖等冷冻保护剂能够提高细胞外囊泡的稳定性[50]。此外，冷冻干燥也可以提高细胞外囊泡的稳定性并延长其保质期[51]。然而，由于细胞外囊泡来源的复杂性，不同来源的细胞外囊泡可能需要独特的存储条件。
除了上述培养、纯化及储存条件外，细胞外囊泡制剂的生产过程需严格遵循现行的良好生产规范。
细胞外囊泡介导的药物递送系统是全球给予厚望的下一代革命性药物递送载体。细胞外囊泡与内部递送的药物协同作用，实现了整体"1＋1>2"的治疗效果。作为一种天然来源的细胞间通讯信使，细胞外囊泡在疾病治疗的递送方面展现出独特的优势和潜力。细胞外囊泡固有的大分子负载能力、高生物相容性、循环稳定性、跨越生理屏障的能力以及对特定组织和器官的靶向能力使其在药物递送方面优于金属纳米粒子、聚合物纳米粒子、碳基纳米粒子和脂质纳米粒子等合成递送载体。在药物递送载体方面，细胞外囊泡具有以下3种优势：（1）细胞外囊泡来源于生物体自身，结构稳定，几乎无免疫原性反应，即使是异种来源的细胞外囊泡在疾病治疗方面也具有极大的安全性。（2）细胞外囊泡天然含有母细胞抗原，具备固有的归巢特性，并且能够主动感知疾病环境，在病灶部分富集。（3）细胞外囊泡还能够有效穿透血脑屏障和胎盘屏障，进入全身的血液循环，为无创伤治疗提供可能。
细胞外囊泡作为细胞间信号传递的主要载体，在肿瘤细胞与免疫细胞的复杂通讯网络中起至关重要的作用，一方面可以促进免疫细胞间信号交流，从而激活下游效应细胞；另一方面能够将肿瘤细胞特异性抗原呈递给免疫系统，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。对于单一疗法难以控制的癌症来说，需要利用化疗、光热等方法联合免疫治疗。尽管细胞外囊泡介导的药物递送系统具有广阔的应用前景，但目前对其研究仍处于初期阶段，仅有少量的外泌体疗法进入了临床试验。细胞外囊泡载药递送系统的研究仍面临囊泡稳定性低、异质性差和目标细胞特异性低等诸多阻碍。肿瘤免疫治疗的未来属于真正以患者为导向的个性化联合治疗方法。
所有作者均声明不存在利益冲突
