人体包含了一个由真核生物、古细菌、细菌和噬菌体等组成的庞大微生物群落。细菌是其中最主要的成员，其数量与人体细胞的数量级相同。许多共生或致病的细菌都会通过生化信号与宿主相互作用。基于这些细菌特性，共生和减毒病原菌已被设计用于递送治疗分子以靶向性治疗特定疾病。介绍了近5年发展的工程微生物或微生物衍生颗粒及其封装、分泌、表达表面治疗分子，综述了其在炎症性肠病及胃病、肿瘤和心血管疾病治疗中的应用进展，并探讨了微生物药物递送系统的临床转化潜力。
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作为生物治疗剂的天然活性物质由于其具有免疫活性、组织靶向性和其他生物活性，在治疗各种疾病方面具有巨大的潜力。早在19世纪后期就有利用热灭活的链球菌和沙门氏菌治疗癌症患者的记录，但由于其毒性大、疗效不稳定，随着化疗的出现逐渐被取代。近年来，随着基因编辑技术的发展和对不同疾病微环境认知的提升，工程微生物治疗又重新回到科学家们的视野中。细菌是天然的免疫佐剂，大多数可以设计成通过激活免疫系统针对肿瘤或细菌的疫苗。大多数微生物表现出特定的组织或细胞偏好，如兼性厌氧微生物倾向于迁移到缺氧的肿瘤组织或肠道，这种特性为构建药物载体提供了重要的支撑。微生物可以很容易地改造和工程化，工程化微生物是指通过基因工程、合成生物学等技术手段对微生物的遗传物质进行改造和调控，使其具备特定的生物学功能或产生目标物质。工程微生物是指通过综合运用化学、物理、生物技术、3D打印等多种技术手段，将合成材料与微生物结合，从而构建出具有特殊功能和反应性的微生物体。对微生物进行工程改造不仅可以产生全新的特性，还能进一步优化微生物的生物功能。工程化微生物属于工程微生物的重要分支，本文主要深入研究了近5年发展的基于不同细菌或真菌的工程微生物，综述了它们在抗炎、抗肿瘤和心血管系统疾病治疗等方面的应用。（图1）
炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一组诱发结肠和小肠长期炎症的疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，这些疾病可能会进一步诱发更严重和致命的疾病，如结直肠癌。活性氧在肠道炎症中起着至关重要的作用。因此，通过过氧化酶和过氧化物歧化酶等抗氧化酶消除炎症部位的活性氧可以有效抑制IBD。IBD的病因和发病机制与肠道黏膜屏障功能和肠道微生物发育不良受损有关，IBD的临床医疗干预主要包括氨基水杨酸盐、抗生素、皮质类固醇和免疫抑制剂。然而，这些药物中的大多数都无法解决IBD的根本原因，如肠黏膜损伤、肠屏障功能受损和肠菌群失衡。长期使用这些药物也容易引起恶心、头痛、痤疮和鼻咽炎等不良反应。益生菌是肠道中的一种有益微生物，已经被广泛用于治疗各种疾病，包括风湿病、衰老、炎症、癌症、肥胖、高血压和糖尿病等。近几年，有很多项利用改造的益生菌治疗结肠炎的研究开展。
将益生菌输送到微生物组是一种有希望的预防和治疗疾病的方法。引入的生物体可以在肠道部位积累，抑制病原体定殖，并积极调节细菌成分的平衡，从而产生有益的效果。已经开发了各种形式的液体、药丸、肠道涂层、聚合物凝胶和干粉，用于递送口服益生菌。这些配方成功地提高了输送效率，但肠道微生物作为口服治疗药物的使用在很大程度上仍然受到限制，原因是其治疗效果有限，生物利用度低，胃肠道保留不足。Cao等[1]报道了一种通过生物界面超分子自组装来覆盖肠道微生物的方法以提高口服细菌的生物利用度和胃肠道保留。利用生物相容性高的脂质与细菌共涡旋，可以在15 min内完成细菌改造。由此制备的脂质膜涂层细菌（lipid membrane coated bacteria，LCB）拥有与天然的细菌几乎一致的生物活性，且在强酸、碱、模拟的胃和肠道液体、抗生素和乙醇等极端条件下的生存率均有提高。与未涂层细菌相比，LCB在小鼠胃中的存活率几乎高出3倍，在肠道中的生物利用度高出4倍多。LCB在伤寒沙门氏菌和右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎小鼠模型的预防和治疗中都显著提高了疗效。2020年，该团队使用聚多巴胺和壳聚糖共沉积修饰益生菌大肠杆菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917，EcN）用于口服治疗小鼠结肠炎[2]。
去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）是一种多巴胺衍生物，可以在温和的条件下发生自聚合生成聚去甲肾上腺素（poly-norepinephrine，PNE），所得到的PNE具有很好的黏附性。Liu等[3]用PNE封装EcN以提高其过胃的能力，延长EcN在肠道中的保留时间。聚(丙烯-硫化物)[poly(propylene sulfide)，PPS]是一种疏水聚合物，其硫原子很容易被活性氧氧化，形成亚砜，亚砜将被进一步氧化产生砜，因此PPS可以用来清除活性氧。研究利用透明质酸（hyaluronic acid，HA）用于修饰PPS得到清除活性氧的纳米粒（HPN），再进一步将HPN结合到EcN表面。口服后，由于益生菌的结肠定殖作用，EcN能够到达IBD部位清除过量的活性氧，联合HPN通过调节免疫反应（如调节巨噬细胞）和作为有效的抗炎剂来治疗小鼠IBD。
EcN经过基因工程改造后可以过表达过氧化氢酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），它们可以有效清除活性氧并缓解炎症[4]。为了保护工程化益生菌过胃，壳聚糖和海藻酸钠2种被美国食品药品监督管理局批准的食品添加剂材料可以通过层层静电自组装包裹在益生菌表面[ECN-pE(C/A)2]。与临床使用的肠用涂层Eudragant L100-55相比，研究中使用的壳聚糖/海藻酸钠涂层对胃肠道中的ECN-pE表现出更好的保护作用。壳聚糖/海藻酸钠涂层益生菌表现出非凡的胃肠道耐受性，并显著改善了口腔生物利用度。ECN-pE(C/A)2治疗表现出有效的活性氧清除和炎症调节作用，明显减少促炎细胞因子，抗炎细胞因子增加，有效地上调了结肠组织中紧密连接相关蛋白的表达水平，并保护结肠上皮细胞免受炎症诱导的凋亡的影响，可以用于口服治疗小鼠结肠炎。
抗生素的滥用在消除病原体的同时可能导致有益的微生物群急剧枯竭。患者寻求益生菌的最常见原因之一是在抗生素治疗过程中恢复肠道中微生物组与有益微生物的平衡。但是在抗生素治疗窗口期，如何保证益生菌不被抗生素杀死是一个亟待解决的问题。Pan等[5]利用由单宁酸和铁离子组成的涂层可以保护细菌免受抗生素的作用。基于单宁酸-铁（Ⅲ）的纳米装甲可保护革兰阳性和革兰阴性细菌免受6种临床相关抗生素的侵害，通过在装甲益生菌附近吸收各种抗生素，为益生菌创造了一个抗生素浓度低的微环境。在动物实验中，使用Eudragit L100肠溶聚合物胶囊保护EcN以安全过胃，使其在肠道中发挥作用，可以显著减少左氧氟沙星治疗引起的抗生素相关腹泻（antibiotic-associated diarrhea，AAD），并改善AAD引起的一些炎症前症状。
Lin等[6]将EcN成功封装到酵母细胞壁（yeast membrane，YM）内得到EcN@YMs，利用YMs耐酸的特性可以保护EcN过胃。酵母细胞壁特有的β-葡聚糖可以靶向肠道上皮的微折叠细胞（M细胞）的C型相关性植物血凝素-1（dendritic cell-associated C-type lectin-1，Dectin-1）受体，提高EcN的摄取效率。口服后将益生菌输送到淋巴滤泡中，显著提高分泌黏膜免疫应答中的主要效应因子免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）的产生。通过基于肠道黏膜免疫介导的肠道菌群调节，EcN@YMs在沙门氏菌刺激下保持肠道稳态和预防沙门氏菌感染中的肠屏障损伤模型中都起到了积极的治疗效果。这项工作为在外部刺激下保持肠道微生物组的组成和功能开拓了新视野，并提出了为细菌介导疗法开发创新疗法的替代方案。除了利用天然的酵母细胞壁保护EcN过胃外，有研究报道了一种静电相互作用介导的碳酸钙矿化修饰在细菌表面形成涂层保护细菌过胃的方法。使用聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）作为稳定剂，通过静电相互作用与带负电荷的细胞表面结合，以防止二代益生菌脆弱拟杆菌BF839聚集。随后，氯化钙与PVP/BF839充分混合后，钙离子被吸收到PVP稳定的BF839细菌表面。最后加入碳酸钠，PVP吸收的钙离子可以引导碳酸钙在BF839表面原位矿化形成矿物涂层。口服后，涂层能够通过自发而快速的双分解反应积极中和胃酸并释放封装的细菌。除了酸中和外，产生的钙离子还可以触发胆汁酸的胶束聚集，双重保护益生菌免受胃酸和胆汁酸的伤害。在小鼠结肠炎模型中治疗效果良好[7]。
除了对炎症性肠病的治疗效果良好，工程微生物在治疗炎症性胃病方面也表现出有潜力的应用。胃酸过多的炎症性胃病通常被称为胃酸过多引起的胃炎或溃疡性胃炎。这是一种胃黏膜受损并发生炎症的情况，其主要原因是胃酸分泌过多或胃黏膜对胃酸过敏。通过利用活化的酵母细胞进行呼吸产生二氧化碳，并在吸收Ca2+后实现酵母细胞内部的CaCO3矿化过程，从而为姜黄素（curcumin，Cur）提供纳米支架。同时，酵母细胞外的CaCO3晶体通过单轴生长为酵母自运动提供了不对称的动力源（Cur@CaY-robot）。Cur@CaY-robot在胃酸中表现出有效的运动能力，使其能深入深层渗透到厚厚的胃黏液中，这大大改善了药物在胃壁组织中的积累，从而实现强大的胃炎治疗效果。此外，Cur@CaY-robot释放的Ca2+还可以协同修复胃炎小鼠的胃运动。这种酵母微/纳米机器人表现出理想的生物相容性和生物降解性，具有良好的药物装载能力[8]。
传统的肿瘤治疗方法如放疗和化疗存在一些局限性，如对正常细胞的毒性作用和耐药性问题等，而工程微生物作为一种新型的治疗策略，为克服这些障碍提供了新的可能性。通过基因工程技术，可以设计和改造微生物，使其具有特定的肿瘤靶向性、肿瘤溶解能力和药物释放功能，从而实现对肿瘤的靶向治疗。工程微生物在肿瘤治疗中的应用不仅可以提高治疗效果，减少毒副作用，还有望开辟个性化治疗的新途径。纳米催化医学是一种新兴的疾病治疗方式，具有高度的特异性和生物安全性，其中纳米催化剂是驱动催化反应产生治疗效果的核心。然而，病理区域的强大防御系统将削弱单纯纳米催化剂的治疗效果。将金和铂金属复合物修饰到细菌表面得到一种多功能菌基纳米酶（Bac-Au@Pt）。利用细菌对肿瘤的靶向能力和金属复合物的酶活性，该体系可以有效在肿瘤部位产生活性氧杀死肿瘤细胞。该纳米酶系统还可以刺激T细胞释放干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ），特异性地降低肿瘤细胞内的抗氧化性。这种纳米系统使化学动力学治疗（chemodynamic therapy，CDT）和免疫治疗互相协同，低剂量的Bac-Au@Pt在免疫治疗的协同作用下也能实现高抗癌效果，是一个非常有潜力的治疗方案[9]。
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，LA）与2D CoCuMo分层双氢氧化物片的耦合（LA&LDH）被报道为精准的近红外二区光动力疗法的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）响应平台。加载在LA上的CoCuMo-LDH纳米片可以被LA代谢物的低pH值和TME过度表达的谷胱甘肽的蚀刻从晶体转化为无定形。TME诱导的CoCuMo-LDH纳米片的原位非晶化可以提高其在1 270 nm激光辐照下产生单体氧（1O2）的光动力活性。这个基于益生菌的肿瘤靶向平台可以在TME原位激活LDH并改善肿瘤TME，作为有效的近红外二区光敏药物，实现高效精确的光动力治疗[10]。
第2代细菌疗法通过基因工程改造增强细菌的抗肿瘤功能或敲除毒力因子获得减毒细菌，极大提高其治疗效果和安全性。随着纳米技术的快速发展，第3代细菌疗法借助功能化的纳米材料辅助细菌疗法，构建"细菌-纳米材料杂合系统"。Ma等[11]利用基因工程和纳米技术模块化设计和制造可以响应于交替磁场的细菌-纳米材料杂合系统。在结肠特异性给药时，主动导航模块为该系统提供原位结肠肿瘤的主动肿瘤靶向。到达肿瘤组织后，信号解码模块中的Fe3O4纳米颗粒使该系统能够接收磁信号并将其转化为热信号。信号反馈模块的热诱导荧光染料释放实现了荧光成像和信号解码行为的监测，磁热引发热敏启动子-启动裂解蛋白的表达，实现细菌的裂解和药物蛋白（抗CD47纳米抗体）的释放。该系统使CD47nb的肿瘤靶向输送成为可能，以避免血液学毒性，并增加CD47nb在肿瘤中的积累，用于精确的肿瘤免疫治疗。
Fan等[12]设计了Ⅱ型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（typeⅡNADH dehydrogenase，NDH-2）过表达的工程大肠杆菌MG1655（Ec-pE）。可以在肿瘤区域定殖，在细菌呼吸过程中，NDH-2接受烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的电子，然后将电子转移到氧气中以产生H2O2。随后，磁性Fe3O4纳米颗粒与细菌共价连接，作为芬顿样反应的催化剂，该反应将H2O2转化为有毒羟基自由基（·OH）用于肿瘤治疗。肿瘤微环境中的乳酸过量总是导致化疗的治疗效果不佳。兼性厌氧菌Shewanella oneidensis MR-1（SO）可以选择性地使用乳酸而不是葡萄糖作为呼吸的能量来源，在这个过程中，SO可以同时介导电子从有机物质转移到具有氧化还原活性的金属矿物的末端电子受体。SO和合成材料之间可以通过电子的转移来建立级联治疗。Wang等[13]将非致病性SO用生物相容性聚(盐酸烯丙胺)[poly(allylamine hydrochloride)，PAH]进行修饰，使细菌表面具有正电荷，并选择MIL-101 MOF纳米颗粒在其内部空间加载抗癌药物阿霉素（doxorubicin，DOX），纳米颗粒表面用带负电荷的透明质酸包裹。DOX加载的MIL-101 MOF纳米颗粒和SO可以通过静电相互作用进行集成，产生生物杂交SO@MIL-101-DOX-HA系统（SO@MDH）。TME中的乳酸将被SO消耗，MOF结构中的Fe3+离子将通过接受来自细菌的电子而减少，导致MIL-101 MOF纳米颗粒的崩溃，以释放化疗DOX。这种基于细菌-金属-有机框架的生物杂交智能细菌，利用菌循环乳酸分解代谢的特性促进化疗。将天然活体系统与合成材料相结合的策略在提高传统化疗的治疗效果方面具有巨大潜力，并为癌症治疗的材料设计提供了新思路。
Wang等[14]将编码络氨酸酶的质粒转到大肠杆菌内构建表达黑色素的细菌（bacteria expressing melanin，BacMel）。与用空质粒转化的黄色细菌群相比，生长在固体介质表面的BacMel呈现深黑色，BacMel在808 nm激发下具有优良的光热效果。即使温度上升到50 ℃，BacMel的生存能力也几乎不受影响。随后，通过在表面沉积聚多巴胺的BacMel修饰免疫检查点抑制剂抗程序性死亡受体-1（anti-programmed death-1，αPD-1）获得内外双重改造的B-αPD-1。黑色素产生的光热增强免疫反应可以协同免疫检查点阻断疗法成功地逆转了免疫抑制TME，在4T1皮下和原位肿瘤模型中，显著抑制肿瘤生长并延长小鼠的生存期[14]。
在自然界中，覆盖细菌表面的糖聚合物荚膜多糖（capsular polysaccharide，CAP）帮助许多细菌保护自己免受包括免疫系统在内的攻击。Harimoto等[15]通过操纵微生物的DNA，编程控制细菌表面的基因回路，构建用于包裹细菌的分子"外衣"。小分子诱导剂异丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）被用来激发EcN表达CAP，"隐身衣"可以帮助细菌躲避免疫系统的追捕，实验表明通过iCAP可以将细菌的最大耐受剂量提高10倍。不给予IPTG饮用水时，随着时间的推移，大肠杆菌会失去CAP的包裹，更容易在身体其他部位被消除，从而将毒性降至最低。进一步改造iCAP系统使大肠杆菌同时表达抗肿瘤毒素，并在结直肠癌和乳腺癌小鼠模型中验证其抗肿瘤作用。
大肠杆菌DH5α是一种兼性厌氧细菌，可以将纳米剂一起用于靶向肿瘤区域，然后在深部肿瘤组织中进行渗透、定植和增殖。作为细菌靶向配体的麦芽糊精（maltodextrin，MD）分子首先基于经典的席夫碱反应与纳米粒子（硅纳米粒子、金纳米粒子及碳点）共价连接。之后，吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）分子作为光敏剂通过静电相互作用吸附在纳米粒上，从而形成ICG-MD-SiNPs/AuNPs/CDs。在此基础上，进一步构建光刺激表达肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的特洛伊纳米细菌系统（TNF-α@EC），在808 nm激光照射下，由于ICG的光热效应，环境温度上升到42 ℃，可以启动TNF-α表达。凭借TNF-α@EC抗肿瘤蛋白的表达和光热效应，特洛伊纳米杆菌能够破坏深部肿瘤组织。该研究增加了基于微生物组的新型工具应对癌症的新兴方法[16]。
同样是操纵细胞因子的表达，Chen等[17]设计了一种可通过聚焦超声诱导的热疗远程控制IFN-γ基因的工程非致病大肠杆菌（MG1655）用于治疗肿瘤。研究首先利用pR-pL启动子构建了携带mCherry荧光报告基因的温控基因表达线路，工程菌在45 ℃孵育后可以观察到强烈的红色荧光信号，表明热诱导可以解除TcI的抑制启动mCherry基因的表达。研究通过将IFN-γ基因替换mCherry基因制备获得了携载IFN-γ温控基因表达线路的工程化细菌，测试了该工程化细菌在超声辐照下的IFN-γ基因表达及其生物学效应。在该研究中，在4.93 MPa声压下，超声3 s，间隔5 s的辐照参数可以将靶区温度维持在45 ℃。发现水浴45 ℃与超声辐照均能诱导工程化细菌表达IFN-γ基因。这种工程菌在全身给药后可选择性地在肿瘤的缺氧区域聚集和生长，使其在超声辐射下局部产生细胞因子IFN-γ，实现了皮下移植乳腺癌及原位移植肝癌的免疫治疗应用[17]。该研究结果可能为深部肿瘤治疗提供一种新的治疗策略，发展一种可在体时空调控基因表达的新方法，可应用于细菌、免疫细胞和干细胞等活体细胞药物的在体基因表达调控，具有潜在的应用价值。
细菌介导的抗肿瘤治疗因其天然的肿瘤靶向性和良好的免疫激活特性而受到广泛关注，以上2种工程化细菌免疫疗法是基于细菌自身表达免疫相关因子，细菌需要尽可能保持活性才能保证充分的免疫相关因子的释放。根据之前的报道，活菌和灭活菌都能诱导先天免疫和适应性免疫，进而改变肿瘤免疫微环境。不同于基因工程化细菌，Pei等[18]使用125I/131I对灭活减毒沙门氏菌VNP20009（VNP）进行放射性标记（125I-VNP/131I-VNP），放射性标记灭活菌具有尺寸优势，能在肿瘤部位长时间滞留，在肿瘤部位长期保留放射性碘，并将其输送到肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM），从而实现具有良好生物安全性的原发性肿瘤的放射性同位素治疗。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌均可以摄取该分子实现光声成像，使用125I/131I对灭活减毒VNP进行放射性标记可以实现伽马成像引导的肿瘤治疗。细菌DNA可以激活环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cyclicGMP-AMP synthase，cGAS）-干扰素刺激基因（stimulator ofinterferon gene，STING）通路，通过上调Ⅰ型干扰素，促进T细胞和自然杀伤细胞的抗癌活性，从而达到抗肿瘤免疫应答的辅助作用。原位注射131I-VNP的放射性同位素治疗联合检查点抑制剂抗程序性死亡-配体1（anti-programmed death-ligand 1，αPD-L1）可显著抑制原位结肠癌的生长，并产生免疫记忆保护作用，实现结直肠癌转移/复发模型中肿瘤的有效消除。这项工作使用灭活的细菌载体作为桥梁，巧妙地将放射治疗和免疫治疗联系起来，为由细菌载体的多效性免疫激活功能介导的放射免疫治疗提供启发。
将细菌与免疫检查点抑制剂结合的递送系统被进一步优化。Li等[19]将肿瘤特异性抗原和检查点阻断抗体的组合通过形成多巴胺纳米颗粒结合到细菌表面。具有光热作用的多巴胺可以将肿瘤相关巨噬细胞再极化为促炎表型。关联的抗原促进树突状细胞的成熟，并产生肿瘤特异性免疫反应，而锚定的抗体会阻断免疫检查点并激活细胞毒性T淋巴细胞。用肿瘤特异性卵白蛋白原和免疫检查点抑制剂αPD-1抗体修饰的EcN，仅需要单次注射加光照射，三重免疫纳米激活剂修饰的EcN在2种卵白蛋白过度表达结肠癌CT26和MC38细胞的小鼠模型中实现了有效的抗肿瘤作用。这项工作为癌症免疫疗法的多模式和长效疗法提供了一个多功能平台，扩展了聚多巴胺修饰细菌的多功能性。
兼性厌氧菌（沙门氏菌和大肠杆菌等）可以定殖于肿瘤组织，为细菌介导的肿瘤治疗提供了便捷。然而，细菌疗法目前依然面临较低的抗肿瘤功效以及剂量相关的毒副作用，主要由于给药后细菌在肿瘤病灶较低的富集率。减毒鼠伤寒VNP临床Ⅰ期试验的失败进一步突显了该问题的严峻性。Geng等[20]提出了一种通过共价偶联来修饰细菌表面的改造方法，即通过一步酰胺化反应将核酸适配体接枝于细菌表面制备适配体偶联细菌（aptamer conjugated bacteria，ApCB），使得修饰细菌具有肿瘤细胞特异性识别作用，从而改善给药后细菌在肿瘤病灶的富集与定殖。与未修饰适配体的细菌相比，小鼠尾静脉注射12、60 h后，ApCB在肿瘤组织的富集和定植分别提高了2、4倍。选用表面核酸适配体（AS1411或TLS11a）修饰的减毒VNP进行了体内抗肿瘤实验，在乳腺癌4T1细胞和肝癌H22细胞小鼠模型中都显著增强了抗肿瘤疗效，同时在肿瘤内引发了显著的免疫反应。
肿瘤细胞表现出CD47"不要吃我"信号的高表达，阻碍了巨噬细胞的吞噬作用。精确有效地激活TAM是肿瘤免疫治疗的一种有前途的方法。细菌衍生的外膜囊泡（outermembrane vesicles，OMV）是高度免疫原性的纳米囊泡，可以强有力地刺激巨噬细胞。Feng等[21]将编码ClyA（OMV表面蛋白质）和抗吞噬细胞受体CD47nb融合蛋白的DNA片段（ClyA-CD47nb）插入表达质粒pET28a中，将质粒转进大肠杆菌BL21内，以生成OMV-CD47nb。叠氮修饰半乳糖（Ac4GalNAz）被添加到细菌培养中，以将氮化物（N3）基团引入细菌外膜上的糖共轭物中，利用IPTG诱导细菌表达ClyA-CD47nb后，超速离心获得含N3基团的外囊泡。通过N3和二苯并环辛炔（dibenzocyclooctyne，DBCO）基团之间的点击化学反应，将OMV-CD47nb涂上DBCO修饰的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）/硒（Se），形成PEG/Se@OMV-CD47nb。PEG/Se@OMV-CD47nb通过多种途径激活肿瘤细胞的TAM吞噬作用，包括诱导M1极化和阻断"不要吃我"信号。TAM的激活通过有效的抗原呈现来刺激T细胞介导的抗肿瘤免疫，表现出对皮下MC38-OVA肿瘤小鼠优秀的治疗效果。
细菌可以绕过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），表明有可能使用细菌来对抗中枢神经系统疾病。Sun等[22]开发基于细菌的光热剂递送系统，用于光热-免疫疗法协同治疗小鼠原位脑胶质瘤，为其命名"特洛伊细菌"。将光热剂ICG负载到葡聚糖链接的硅纳米颗粒中，其可以被兼性厌氧细菌[VNP、大肠杆菌25922（EC）]通过特异性ATP结合盒转运体内吞，构建了2种特洛伊细菌（Trojan EC、Trojan VNP）。研究表明静脉注射的特洛伊细菌可以绕过血脑屏障，瞄准并穿透脑胶质瘤组织。在808 nm激光照射下，ICG产生的光热效应允许破坏细菌细胞和邻近的肿瘤细胞。此外，细菌碎片以及肿瘤相关抗原促进抗肿瘤免疫反应，延长携带脑胶质瘤的小鼠的存活时间。大肠杆菌K1（Escherichia coli K1，EC-K1）也被报道可绕过血脑屏障引起脑膜炎，研究表明紫外光照射下失活的EC-K1没有致病性且能够保持原有结构和趋化性。Lu等[23]研究表明EC-K1通过细菌特异性的麦芽糖转运体途径吞噬经麦芽糖修饰的药物，然后通过紫外线照射失活。EC-K1外膜蛋白A可以与小鼠脑微血管内皮细胞表达的受体gp96结合，促进EC-K1的摄取。非活性特洛伊木马EC-K1可以采取治疗药物，并在静脉注射到小鼠体内后一起绕过血脑屏障。该方法可以作为一种模板方案递送不同的治疗剂到小鼠大脑中。
心血管疾病成为世界上最危险的疾病，血栓形成在很大程度上导致了心血管疾病患者的死亡。动脉中的血栓可能导致缺血性卒中、心肌梗死、长期残疾甚至死亡。静脉中的血栓可能导致肺栓塞，可能导致致命的呼吸和心力衰竭。有效的溶栓对于快速重建血栓患者血流至关重要。现存的药物递送系统在及时清除密集纤维蛋白网络的血凝块方面仍然存在不足。尿激酶和组织纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，tPA）是2种常用的静脉输注溶栓剂，可以积极溶解血栓或激活溶栓途径。但是它们的半衰期很短（尿激酶为10～15 min，tPA为2～5 min），有效溶栓通常需要高剂量重复给药。因此，有研究者开发细菌马达推进的聚多巴胺微管用来递送溶栓药物尿激酶，以实现血凝块的渗透和有效的溶栓[24]。使用静电纺丝技术制备苯乙烯-马来酸酐共聚物（polystyrene-co-maleic anhydride，PSMA）的对齐纤维，然后浸入含有多巴胺、尿激酶和岩藻多糖的Tris缓冲液中，以获得FuPDAuPA@PSMA纤维。随后，通过冷冻切割获得纤维碎片，溶解PSMA芯可以获得FuPDAuPA微管，在L-天冬氨酸诱导下实现PDA黏附将EcN加载到FuPDAuPA中，组装以获得FuPDAuPA@EcN微马达。岩藻多糖可以靶向活化的血小板表面的P-选择素，通过EcN驱动的运动渗透到血栓中，大肠杆菌的运动可以增强微马达和血管壁上凝块的相互作用，随后释放尿激酶以破坏血栓，有效提高了尿激酶的半衰期，生物利用度比单独使用尿激酶高出10倍以上。岩藻多糖的靶向能力和EcN驱动运动的协同作用为促进溶栓并减少尿激酶原激活物剂量和相关出血不良反应提供了有力支持。
本文研究了近5年发展的工程微生物，综述了其在抗炎、抗肿瘤和心血管疾病治疗方面的应用。部分细菌疗法，如减毒VNP的临床肿瘤治疗效果并不乐观。临床结果表明，仅有少部分患者瘤内可检测到细菌的定殖，而该少部分患者也未有显著的治疗获益。菌株在人体内的工作机制仍然不清楚，仍需要在动物模型中进行更多探索和验证。还需要进一步考虑提高基于工程微生物疗法的治疗效果，"增效减毒"仍然是一个重要的目标。在时间和空间上控制细菌的活性是一个很有前景的方向，比如进一步完善响应于疾病部位特征的"识别和响应系统"，设计更精细的基于光照、超声和磁场激发的响应性体系。工程微生物作为为疾病部位提供高特异性治疗干预的负担得起的手段，前景巨大。虽然关于工程微生物作为治疗的长期效用还有悬而未决的问题，但鉴于微生物的遗传可修改性，有可能根据需要修改菌株以降低其潜在的不利影响。总体而言，工程微生物领域最近的进展为治疗各种疾病的创新平台铺平了道路。
所有作者均声明不存在利益冲突
