分析IL-18、IL-18结合蛋白（IL-18BP）在骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓液中的表达水平及临床意义。
纳入2020年7月至2021年2月天津医科大学总医院血液科收治的初诊MDS患者43例，对照组包括急性髓系白血病（AML）患者14例、缺铁性贫血（IDA）患者25例，检测骨髓上清中IL-18和IL-18BP水平，分析其与MDS的严重程度、CD8+ T细胞及NK细胞功能的相关性。
MDS患者骨髓上清中IL-18、IL-18BP和游离IL-18（fIL-18）的水平均高于IDA组，fIL-18的水平与MDS-IPSS评分呈线性负相关。MDS患者CD8+ T细胞表面IL-18受体（IL-18Rα）表达低于IDA组，fIL-18及IL-18Rα水平均与MDS患者CD8+ T细胞功能呈正相关。
IL-18在MDS患者骨髓微环境中表达增加，但由于IL-18BP的存在导致fIL-18相对减少，与MDS疾病严重程度和CD8+ T细胞功能减低有关。
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骨髓增生异常综合征（MDS）是髓系克隆造血导致的血液系统恶性疾病，表现为血细胞减少、骨髓病态或无效造血，高风险向急性髓系白血病（AML）转化[1]。免疫机制在MDS的发病中发挥重要作用[2]。IL-18是一种多效性促炎细胞因子，参与先天性和适应性免疫反应的调节[3]。在IL-12和（或）IL-15存在的情况下，IL-18诱导巨噬细胞、NK细胞、T细胞和B细胞产生干扰素γ（IFN-γ）；IL-18与IL-23结合可促进Th17细胞的生长[4,5]。在IL-18的刺激下NK细胞及T细胞抗肿瘤作用均增强[6]。研究显示IL-18在包括MDS在内的多种肿瘤患者中表达增高[7]，但给予IL-18治疗未能发挥预期抑制肿瘤生长的理想疗效[8]。IL-18结合蛋白（IL-18BP）是一种天然的游离免疫检查点蛋白，可竞争性抑制IL-18与其受体（IL-18Rɑ）结合，且与IL-18的亲和力远高于IL-18Rɑ。目前已发现IL-18BP在多种肿瘤[9,10,11]和自身免疫性疾病[12,13]中高表达，但在MDS患者中的作用尚不清楚。本研究检测了MDS患者骨髓上清中IL-18和IL-18BP的表达水平，探讨在MDS患者中检测的临床意义。
回顾性分析2020年7月至2021年2月在天津医科大学总医院血液科确诊的43例初治MDS患者及对照病例[AML患者14例、缺铁性贫血（IDA）患者25例]。所有患者均完成骨髓穿刺、骨髓病理、染色体核型、组织化学分析等相关检查，排除感染、实体肿瘤及其他血液系统疾病。MDS患者符合2016年WHO诊断分型标准，AML患者符合2017年WHO诊断分型标准。该研究经天津医科大学总医院伦理委员会批准（批件号：IRB2019-210-01）。收集所有患者外周血及骨髓液3 ml到EDTA抗凝管中，室温下1 000×g离心15 min，吸取500 μl上清至1.5 ml无酶EP管中，密封在-80 ℃冰箱中保存，备后期检测IL-18和IL-18BP的表达水平。
本研究使用的人IL-18 ELISA试剂盒（最小检测限为20 pg/ml）、人IL-18BP试剂盒（最小检测限为47 pg/ml）均购自北京博奥森生物技术有限公司。使用酶标仪Elx800（美国Bio Tek公司产品）按照试剂盒说明进行检测操作。在测量每个样品IL-18和IL-18BP的浓度后，采用质量作用法[14]计算游离IL-18（fIL-18）的水平（即没有与其抑制剂IL-18BP结合的细胞因子的部分）。已知IL-18的相对分子质量为18.4×103，IL-18BP的相对分子质量为17.6×103，IL-18和IL-18BP按1∶1结合，其相互作用的Kd值为0.4 nmol/L。
CD3-PerCP、CD8-APC-CY7、IL-18Rα-PE、PD-1-PE-CY7、TIM-3-BV421、IFN-γ-FITC、Perforin-APC、Granzyme B-BV421用于检测CD8+T细胞的数量及功能；CD3-PerCP、CD56-FITC、IL-18Rα-PE、PD-1-PE-CY7和TIM-3-BV421、IFN-γ-FITC、Perforin-APC、Granzyme B-PE-CY7用于检测NK细胞的数量及功能。运用流式细胞仪CytoFLE进行检测，利用CytExpert进行数据分析。
采用SPSS 25.0统计软件和GraphPad Prism 5.01统计软件进行数据分析和图形处理。连续变量的正态性判定采用Shapiro-Wilk检验，若为正态分布则用
±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。若为非正态分布则用M（IQR）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验，进一步采用Dunn法进行多重比较。两个变量的相关性分析采用Pearson或Spearman法。双侧P<0.05为差异有统计学意义。
MDS患者和AML患者骨髓上清中IL-18表达水平分别为（211.30±157.20）ng/L和（202.90±102.40）ng/L，均明显高于IDA组的（84.97±64.78）ng/L（P值分别为<0.001、0.004）。MDS患者和AML患者的IL-18BP表达水平分别为（33 149±12 134）ng/L和（40 221±14 259）ng/L，均明显高于IDA组的（21 796±7 858）ng/L（P值分别为0.004、<0.001）。MDS患者和AML患者的fIL-18表达水平分别为（38.40±25.88）ng/L和（31.15±14.34）ng/L，MDS患者的fIL-18水平显著高于IDA组的（22.84±18.66）ng/L（P=0.039）（图1），较AML组表达水平差异无统计学意义（P=1.000）。
注 MDS：骨髓增生异常综合征；AML：急性髓系白血病；IDA：缺铁性贫血；IL-18BP：IL-18结合蛋白；nsP>0.05、aP<0.05、bP<0.01、cP<0.001
为探究IL-18BP对IL-18的拮抗作用是否仅局限于骨髓原位，我们对31例MDS患者骨髓及外周血同时采样，分别检测IL-18、IL-18BP水平并进行Pearson相关性分析。结果显示MDS患者外周血与骨髓的IL-18（r=0.935，P<0.001）、IL-18BP（r=0.897，P<0.001）均呈正相关，提示二者具有很好的一致性（图2）。
根据修订版MDS国际预后评分系统（IPSS-R），将43例初治MDS患者分为相对高危组（>3.5分）和相对低危组（≤3.5分）。分析发现，相对低危组患者IL-18BP的表达水平与相对高危组比较差异无统计学意义[（32 351±12 178）ng/L对（33 723±12 321）ng/L，P=0.932]。相对低危组患者的fIL-18的表达水平明显高于相对高危组[（50.26±30.15）ng/L对（29.85±18.61）ng/L，P=0.016]（图3）。
注 IPSS-R：修订版MDS国际预后评分系统；IL-18BP：IL-18结合蛋白；fIL-18：游离IL-18；nsP>0.05、aP<0.05
骨髓上清中fIL-18与骨髓原始细胞比例（r=-0.36，P=0.03）、国际预后积分系统（IPSS）评分（r=-0.35，P=0.02）、IPSS-R评分（r=-0.38，P=0.01）和WHO分型预后积分系统（WPSS）评分（r=-0.31，P=0.04）均呈负相关。
在与突变基因相关性的研究结果显示：DTA（DNMT3A、TET2、ASXL1）基因突变与IL-18BP水平呈正相关（r=0.412，P=0.008），但与IL-18水平（r=0.18，P=0.25）、fIL-18（r=-0.07，P=0.65）无明显线性相关性。剪切子相关基因突变（SF3B1、U2AF1、SRSF2和ZRSR2）与IL-18（r=0.15，P=0.34）、IL18BP（r=0.09，P=0.60）、fIL-18（r=0.16，P=0.33）均水平无明显线性相关性。
MDS患者和AML患者CD8+ T细胞分泌穿孔素水平分别为（12.35±9.71）%和（7.80±4.10）%，均显著低于IDA组的（22.25±13.66）%（P值分别为0.040、0.001）。MDS与AML患者骨髓CD8+ T细胞分泌的穿孔素水平差异无统计学意义（P=0.622）。MDS患者和AML患者骨髓CD8+ T细胞分泌的IFN-γ水平分别为（16.65±15.11）%和（11.13±9.31）%，明显低于IDA组的（29.17±17.11）%（P值分别为0.027、0.002）（图4）。MDS、AML和IDA组患者骨髓CD8+ T细胞分泌的颗粒酶B水平分别为（38.46±15.40）%、（39.81±14.31）%和（43.94±18.97）%，组间差异无统计学意义（P=1.000）。
注 MDS：骨髓增生异常综合征；AML：急性髓系白血病；IDA：缺铁性贫血；IL-18Rα：IL-18受体；nsP>0.05，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
MDS及AML患者PD-1+CD8+/CD8+细胞比例分别为（43.44±16.17）%和（40.73±23.30）%，均显著高于IDA组的（22.63±11.91）%（P值分别为<0.001、0.020）。MDS和AML患者TIM-3+CD8+/CD8+ T细胞比例分别为（42.12±19.51）%和（38.16±19.45）%，均显著高于IDA组的（20.77±12.70）%（P值分别为<0.001、0.031）。MDS和AML患者的PD-1+TIM-3+CD8+/CD8+ T细胞比例分别为（17.55±11.57）%和（16.21±15.75）%，均显著高于IDA组的（6.78±4.90）%（P值分别为<0.001、0.013），提示MDS和AML患者CD8+ T细胞存在免疫耗竭状态（图5）。
MDS患者和AML患者CD8+ T细胞上IL-18Rα的表达水平分别为（57.44±15.37）%和（55.94±13.32）%，均显著低于IDA组的（69.32±14.98）%（P值分别为0.036、0.048），MDS和AML患者之间差异无统计学意义（P=1.000）（图4）。
MDS患者骨髓上清中fIL-18表达水平与CD8+ T细胞分泌的穿孔素（r=0.54，P=0.04）和IFN-γ（r=0.64，P=0.01）呈正相关，与颗粒酶B无明显线性相关性（r=0.29，P=0.30）；CD8+ T细胞表面的IL-18Rα与穿孔素、颗粒酶B及IFN-γ表达水平均呈正相关（r值分别为0.60、0.53、0.52，P值分别为0.02、0.04、0.03）。但MDS患者骨髓上清中的IL-18BP水平与穿孔素、颗粒酶B及IFN-γ表达水平均无明显线性相关性（r值分别为0.01、0.09、-0.29，P值分别为0.96、0.74、0.29）。本研究并未发现MDS患者骨髓上清中IL-18BP、fIL-18及IL-18Rα与PD-1+TIM-3+CD8+ T细胞比例的线性相关性，提示IL-18或fIL-18水平可能与CD8+ T细胞耗竭无显著关联。
MDS患者骨髓NK细胞分泌的穿孔素水平显著低于IDA组[（57.36±23.81）%对（78.21±12.36）%，P=0.042]，颗粒酶B水平明显低于IDA组[（57.44±15.37）%对（69.32±14.98）%，P=0.034]，骨髓NK细胞上IL-18Rα的表达水平显著低于IDA组[（63.61±20.40）%对（81.30±11.10）%，P=0.040]（图6）。
MDS患者骨髓上清中的fIL-18（r=0.07，P=0.83）、IL-18BP（r=0.08，P=0.80）、IL-18Rα（r=0.07，P=0.82）表达水平与骨髓NK细胞分泌的穿孔素无明显线性相关性；fIL-18（r=0.14，P=0.66）、IL-18BP（r=0.16，P=0.61）、IL-18Rα（r=-0.21，P=0.50）表达水平与骨髓NK细胞分泌的颗粒酶B无明显线性相关性。
MDS是造血干细胞的一种恶性克隆性疾病，以无效和病态造血为特征，可转变为AML。MDS的发病机制涉及许多因素，包括细胞遗传学变化和分子异常，如基因突变和表观遗传学变化，以及细胞免疫和免疫微环境的紊乱等。
IL-18是一种促炎症和免疫调节因子。在一些临床前模型中已经发现IL-18具有抗肿瘤活性[15,16]。重组IL-18（rIL-18）通过激活CD4+、CD8+ T细胞和（或）NK细胞介导的反应，可消除小鼠黑色素瘤或肉瘤[17]；在小鼠模型中，rIL-18与免疫检查点抑制剂（ICI）和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）具有协同作用[18]。尽管在动物实验中显示出显著疗效，但IL-18在临床应用上却未见明显有效性[19]，这引起广泛研究者的困惑。这种困惑持续到人们发现了IL-18BP。很多研究表明，肿瘤微环境中不同因素介导了IL-18BP的表达，IL-18BP限制了IL-18与其受体的结合，从而降低IL-18的生物活性。这一发现揭示了肿瘤通过IL-18BP表达来逃避免疫反应的潜在机制，对肿瘤治疗研究具有重要意义。
本研究发现，MDS患者骨髓上清中IL-18表达水平明显升高，这说明MDS体内存在抗肿瘤的炎症反应，但我们同样发现IL-18BP表达水平也同步升高，这就抑制了IL-18抗肿瘤作用。根据质量作用定律[14]和骨髓上清中IL-18和IL-18BP的表达水平，我们计算了MDS患者骨髓fIL-18的表达水平，发现MDS患者fIL-18的表达水平仍高于IDA组，并且fIL-18在MDS中高于AML，说明在MDS阶段，机体的有效炎症反应强于AML。本研究还发现不同分期的MDS患者骨髓fIL-18的表达水平也不相同，相对低危组MDS患者fIL-18的表达水平高于相对高危组。
肿瘤患者的CD8+ T细胞及NK细胞不仅发挥免疫监视作用，而且是机体杀灭肿瘤细胞最主要的武器。本研究再次验证了MDS患者CD8+ T细胞及NK细胞分泌功能分子（如穿孔蛋白、颗粒酶、IFN-γ）的能力减低。且由于CD8+ T细胞及NK细胞表面IL-18Rα表达减少，导致fIL-18促进CD8+ T及NK细胞活化能力减弱。MDS患者骨髓CD8+ T细胞存在耗竭状态，MDS患者的PD-1+TIM-3+CD8+ T细胞比例增高，但本研究并未发现IL-18BP、fIL-18以及IL-18Rα与骨髓CD8+ T细胞表面PD-1和TIM-3的表达水平的相关性，说明IL-18通过调节IL-18Rα调控T细胞的功能，可能并未参与CD8+ T细胞耗竭的过程。
近期，Zhou等[8]创造了一种诱饵受体DR-18，可以有效地防止IL-18被IL-18BP中和，但不影响IL-18与IL-18受体结合，介导下游的信号转导。该药物目前正在进行临床开发，未来有望用于多种肿瘤性疾病的治疗。本实验证实MDS患者骨髓上清中IL-18的表达水平虽然不低，但由于IL-18BP的存在导致fIL-18表达水平相对不足，加之MDS患者CD8+ T和NK细胞表面IL-18Rα的下调，导致CD8+ T和NK细胞炎症反应能力不足，抗肿瘤功能受抑。因此，IL-18BP拮抗剂和（或）促进IL-18受体上调的药物，有望成为治疗MDS的新选择。
所有作者声明不存在利益冲突
