纳米囊泡药物递送载体包括合成的脂质体载体和天然的外泌体等。常见的人工纳米级载体脂质体由于其益于工程化和良好的靶向性，是一种理想的药物递送载体。内源性的外泌体由于具有较小的粒径和能够传递信息等功能，也逐渐应用于药物载体的研究中，并在改善药物递送靶向性、提高药效发挥和具备良好的生物相容性等方面表现出强大的优势。主要综述了脂质体和外泌体等纳米囊泡药物递送载体在肿瘤药物递送方面的应用，包括脂质体的多种工程化模式及外泌体的多种提取方式，为肿瘤药物的递送载体提供借鉴思路和新的可能。
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据2020年全球癌症数据统计显示，当年全球新出现的恶性肿瘤为1 930万例，预计到2040年全球新增癌症病例或将高达2 840万例[1]。针对癌症，其治疗方案也在日益增多，如传统的手术切除、化学疗法、放射疗法，以及处于探索阶段的免疫疗法[2]。在众多治疗策略中，利用药物递送系统输送纳米药物具有改善药物的理化性质使其易于发挥药效、靶向递送药物增强治疗效果、包裹药物降低药物毒副作用等优势[3]，成为了治疗肿瘤的有利手段，而这也推动了药物递送载体材料的产生与发展。其中，纳米囊泡由于具有促进药物在组织中的保留、防止酶降解、增强细胞摄取以及高度靶向递送等优势[4]，在药物递送及肿瘤治疗中表现出很好的应用潜力。纳米囊泡药物递送系统包括脂质体和外泌体等，它们均在肿瘤药物递送方面展现出了强有力的优势。因此，本文主要综述脂质体和外泌体等纳米囊泡作为抗肿瘤药物递送载体的研究进展，旨在为抗肿瘤药物递送载体的设计与应用提供新的思路。
20世纪60年代，Bangham等[5]首次发现并提出了脂质体的概念，它是一种类似于脂质双分子层包裹的球型囊泡，通常为纳米级，部分脂质体的大小可达到几十微米。内部空心的亲水端和脂质双分子层中的疏水端让脂质体具备了与亲水性化合物和亲脂性化合物均能良好结合的双重功能。20世纪70年代，脂质体首次被Rahman等[6]作为一种载药工具使用。此后，脂质体经过不断优化，由最初简单的模型衍生出了多种能够解决不同药物递送问题的结构。按照脂质体中双分子层的数量可以分为单室脂质体、多室脂质体和多囊脂质体[5]；按照脂质体所带电荷又可分为正电荷脂质体、负电荷脂质体和中性脂质体；部分具有靶向性的脂质体还可以依据其靶向作用分为被动靶向、物理化学靶向和主动靶向型脂质体，像温敏脂质体、磁响应脂质体、光敏脂质体和pH敏感脂质体等属于物理化学靶向脂质体，而受体靶向脂质体、抗体靶向脂质体等则属于主动靶向型脂质体[5]。随着研究的深入，脂质体表现出了益于工程化、靶向给药、缓控释给药等诸多优势，给肿瘤的药物治疗带来了曙光。
长循环脂质体是一种比较成熟的药物载体模型，这类脂质体的表面被聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）及其类脂衍生物或其他材料所修饰。在这些材料修饰的条件下，携带药物的长循环脂质体能够降低被体内网状内皮系统清除的概率，延长药物在血液循环中的时间，利于药物在靶细胞或组织附近积累并提高药效[7,8]。1995年美国上市的盐酸多柔比星脂质体（Doxil®）和2009年国内上市的盐酸多柔比星脂质体（里葆多®）都是载有多柔比星的长循环脂质体药物。
在深入研究肿瘤组织与正常组织间的差异时，人们又对脂质体进行优化，衍生出了环境响应型脂质体，如pH敏感脂质体。pH敏感脂质体充分利用了肿瘤组织环境呈酸性而正常组织血浆pH接近中性的差别，使得它能特异性地靶向pH较低的肿瘤组织，而且在酸性环境下能够依靠膜结构的变化让脂质体更容易与靶细胞结合，由此增强了药物聚集的特性，降低了全身毒性[6,8]。
在脂质体作为药物载体治疗疾病的几十年中，涌现出了不少有效的药物，一些药物是针对特定靶器官而研发的，如国内已上市的治疗卵巢癌的紫杉醇脂质体（力扑素®）、2012年在美国上市的用于治疗白血病和霍奇金淋巴瘤的硫酸长春新碱脂质体（Marqibo®）；一些药物对各类癌症都有效，如1995年上市的Doxil®、1996年上市的载有柔红霉素的脂质体（DaunoXome®）；除了治疗肿瘤，还有治疗其他疾病的脂质体药物也在不断问世，如递送小干扰RNA用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的patisiran脂质体（Onpattro®）、2021年用于治疗新型冠状病毒肺炎的疫苗Comiranty®[9]。除了已经上市的脂质体药物，还有许多具有潜力的抗肿瘤药物也都逐渐进入了临床研究阶段，现如今，为了让脂质体作为药物载体发挥更大的作用，许多不同种类的脂质体也在被尝试进行联合使用。
脂质体在进入人体后，由于表面存在亲水性物质的修饰，因此能够有效改善网状内皮系统的快速吞噬效应，使大量携带药物的脂质体有更多到达病灶的可能性。其次，脂质体充分利用了肿瘤组织中的渗透与滞留增强效应，它可以从血管壁间隙渗透并聚集在肿瘤组织中，这不仅降低了药物在其他正常组织中的积累量，而且提高了有效发挥药效的药量[10]。同时，通过对脂质体表面改造，如修饰能够与肿瘤细胞特异结合的抗体[11]、增加pH敏感材料、调节脂质体表面电荷等，可以进一步加强其对肿瘤组织的靶向性。若是修饰能够抑制肿瘤组织血管新生的配体材料，还可以在释放药物的同时阻断肿瘤组织血管的生成。
脂质体作为常见的纳米药物递送载体，虽然一定程度上能够提高药物靶向性、减少全身不良反应和提高药物疗效等，但进入人体后仍有许多体内屏障无法通过，而且部分药物也会被体内的单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocyte system，MPS）清除，导致进入肿瘤细胞的药量下降[12]。由于多数脂质体是由PEG和聚环氧乙烷等材料人工构建，所以进入人体后，会出现一定的免疫原性和药物释放率低的情况[13]。其次，脂质体携带药物进入人体后，会影响巨噬细胞的吞噬活性并在内部累积，导致免疫抑制[14]，如特别有希望被应用于临床的分子靶向脂质体，被发现在进入人体内仍旧存在被免疫细胞吞噬的风险，而物理靶向脂质体又会给药物的可控释放增加难度。再者，脂质体的制备工艺和稳定性等也需要经过更加深入地研究才能得到肯定答案[6]。因此，脂质体的广泛应用受到了一定的限制。
20世纪40年代，Chargaff等[15]在健康人的血浆中发现了一种可以促进凝血的细胞外囊泡。1969年，人们在正常小鼠的软骨基质内发现了一种可能在骨骺钙化中起作用的囊泡[16]。1983年，Pan等[17,18]在绵羊红细胞上清液中发现了一种有膜结构的小囊泡，并在1989年将这种具有功能的囊泡正式命名为外泌体。外泌体是一种胞外囊泡，可以作为细胞间远距离传递信号的方式，直径在30～150 nm，表面是一层由脂质和蛋白质结合形成的脂质双分子层生物膜，广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液、乳汁、羊水和腹水等体液中[19]。由于具有较小的粒径和能够传递信息等功能，外泌体逐渐被作为纳米药物载体应用，并在改善药物递送靶向性、提高药效发挥和具备良好的生物相容性等方面表现出强大优势[19]。除此之外，外泌体也可以进行一定的修饰改造，如用pH敏感肽修饰外泌体，使其成为用于缺氧肿瘤微环境药物递送的载体[20]。
鉴于外泌体具备的诸多优势，如何高效提取分离外泌体也成为许多学者研究的方向，因为足够量纯化的外泌体才是开展后续研究的基础。目前，根据外泌体的理化性质，不少分离纯化技术应运而生，常见的有超速离心法、超滤法、尺寸排阻色谱法、免疫捕获法、聚合物沉淀法、微流控技术法、磁珠免疫法和试剂提取法等。
该方法利用外泌体的密度和大小与其他细胞等物质不同的特点，将低速离心与高速离心相结合，利用较小离心力（300、1 000、2 000、10 000×g等）先将提取液中的细胞及细胞碎片进行去除，再用高速离心（105×g以上）得到外泌体沉淀，最后可利用磷酸盐缓冲液重悬后，再次高速离心去除蛋白杂质，得到外泌体。该方法易于操作，使用较为广泛，被称之为外泌体提取分离的金标准[21]。
超滤法同样利用了外泌体的大小与其他物质有差异的特点对外泌体进行分离提取，它利用不同孔径（0.22、0.45、0.80 μm）的超滤膜达到分离出外泌体的目的[22]。这种方法简便快捷，而且对仪器没有需求，但是膜的选用以及滤过产生的压力可能会对外泌体生物活性造成影响，从而影响后续实验。尺寸排阻色谱法与超滤法类似，它是一种利用多孔凝胶固定相孔径大小与外泌体大小之间的关系对外泌体进行分离的方式[23]。利用尺寸排阻色谱法得到的外泌体在大小上会相对均一，但在对样本进行处理时可能会对其有所稀释，且费用相对较高。
免疫捕获法利用了抗体与外泌体表面的膜蛋白能够进行特异性结合的特点，通过和CD63、CD9、CD81等膜蛋白进行结合，达到分离外泌体与其他物质的目的[24]。该方法特异性强，分离得到的外泌体纯度高，但不足之处在于不能用于大量提取外泌体，而且成本较高，同时还要考虑提取得到的外泌体如何与表面抗体分离等问题。
外泌体的提取分离方法众多，不同方法的优缺点也不尽相同，在实验过程中常根据实验目的、仪器设备条件和提取耗时情况等对方法进行选择，保证所提外泌体符合后续实验要求。
外泌体可以通过多种途径产生，其中，由内体途径产生外泌体的过程备受关注[25]，这一途径依赖于细胞的内吞作用，即细胞质膜首先向内凹陷使细胞质、大分子、细胞膜和受体等发生内化，形成细胞内囊泡，这些囊泡在细胞内进一步形成核内体，也被称之为早期内体。在高尔基体的帮助下，早期内体能够以出芽的方式向内萌发腔内囊泡形成晚期内体。晚期内体中存在大量包裹着蛋白质、RNA等物质的腔内小泡，因为此时的晚期内体中有大量腔内小泡的存在，所以又被称之为多泡体。部分多泡体会和溶酶体发生融合，使得囊泡及其内容物被溶酶体降解消化掉，其余的多泡体将会与母细胞的细胞质膜发生融合，把内囊泡释放到细胞外的基质中，即产生外泌体[25,26]。
外泌体的产生过程使得外泌体内存在着亲本细胞中的一些活性物质，如DNA、mRNA、微小RNA等核酸类物质，也有一些结构蛋白（微管蛋白、肌动蛋白和膜联蛋白）和特异性蛋白，还有像胆固醇、神经鞘磷脂和神经酰胺等能作为生物标志物的脂类，以及来自细胞核、线粒体、内质网和高尔基体的一些其他成分[27]。一些物质是几乎所有外泌体共有的，如热休克蛋白、多泡小体蛋白（TSG101）、四跨膜蛋白（CD9、CD63和CD81）和整合素等，因此这类共有的蛋白质也常被用作外泌体检测的标志物[28]。由于外泌体的来源十分广泛，几乎所有的细胞都能产生外泌体，因此它的内容物也不完全相同，不同来源的外泌体中可能含有其特有的物质，如来源于红细胞的外泌体表面有转铁蛋白受体等，这将有助于其作为药物载体发挥相应功能。
外泌体搭载药物的方式可根据载药时间的不同分为内源性和外源性2种。内源性药物装载是指利用共孵育或基因工程对亲代细胞进行预处理，使药物在细胞分泌外泌体前装载。Cheng等[29]利用基因工程技术将合成多价抗体装载到外泌体中，开发了无细胞乳腺癌免疫疗法。其中，共孵育是内源性装载药物的常用策略，因为它操作简单，成本低。外源性药物装载则是在分泌和分离外泌体的过程中装载药物。这种装载方式主要用到的技术有电穿孔、超声、挤压和冻融循环等。其中，电穿孔是利用电流在外泌体的磷脂双分子层上打孔，以增加药物的掺入比，达到较高的载药率。膜渗透法是利用外泌体表面的胆固醇和表面活性剂的相互作用，诱发外泌体膜的通透性增强，从而搭载药物[30]。不同的药物装载方式让外泌体作为药物递送载体有了更多利用空间。
纳米级的外泌体作为一种细胞间信息交流的"通勤车"，能够广泛存在于体液中，而且因为其良好的生物相容性、天然的脂质双层结构和稳定携带蛋白质等优势，在疾病的治疗特别是肿瘤治疗中具有极高的关注度。
外泌体作为药物载体既能够递送小分子药物，也能够携带蛋白等大分子物质，而且不同细胞来源的外泌体，其功能也有所差异。肿瘤治疗中常见的小分子化疗药物多柔比星，由于存在心脏毒性等不良反应，导致其在临床使用中受限。Hadla等[31]利用乳腺癌细胞来源的外泌体装载多柔比星后，在小鼠模型中发现包裹多柔比星的外泌体比单独使用多柔比星的治疗效果更好，而且心脏毒性更低。Barok等[32]发现乳腺癌细胞来源的外泌体能够和蛋白类药物曲妥珠单抗相结合，并且该外泌体也能携带曲妥珠单抗到其他癌细胞，达到有效抑制癌细胞的目的。在体内，巨噬细胞的血液半衰期很长，具有吞噬异物的特性，而且可以和肿瘤细胞之间发生特异结合，如小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7表面具有的α4和β1整合素，能够与肿瘤细胞的血管细胞黏附分子-1相互作用[33]。Kim等[34]利用氨基乙基茴香酰胺聚乙二醇修饰的外泌体搭载紫杉醇，该药物在肺转移小鼠模型中具有良好的抗癌功效，体现出了高载药量、高靶向性和可全身给药等特点。研究证实，巨噬细胞衍生的外泌体仍具有其母细胞趋向肿瘤细胞和炎症环境的特点，具有良好的肿瘤靶向性[35]。除此之外，研究还发现，巨噬细胞来源的外泌体能够利用细胞表面的信号分子与脑微血管内皮细胞相结合，实现跨越血脑屏障的目的[36]，这也是外泌体能够作为药物载体治疗脑部疾病的原因所在。
将内源性外泌体作为药物载体，不仅解决了传统人工载体进入体内积蓄毒性较高、生物相容性较低的缺陷，而且由于其具备粒径较小、稳定性和递送效果较好以及能够穿透体内多种屏障等特点，越来越多的实验室已经开始将其应用到更为广阔的领域。
脂质体作为一种人工纳米载体，已经在部分药物递送中显示出了降低药物毒副作用和提高药效等优势，但是在逃避单核吞噬细胞系统的清除、提高血液中存在时间和靶向肿瘤细胞等方面的表现仍不是很理想，而且在研究过程中也发现制备脂质体所用的材料在人体内还会存在一定的免疫原性。相比之下，内源性的外泌体在体内能够相对稳定存在，具备更好的生物相容性，其表面的多种蛋白如CD9、CD47和CD81等有助于其和靶细胞更好融合，而且能够跨越血脑屏障等多种体内生物屏障。但是，外泌体作为药物递送载体也有一定的应用限制：天然外泌体的大规模生产难以实现，标准化的外泌体提取方式仍未达成一致[37]；其次，天然外泌体的治疗效果也受到药物装载率的影响[37]，因此如何最大程度地利用外泌体作为药物载体的优势成为值得商榷的问题。
为了充分发挥脂质体和外泌体的双重优势、取长补短，融合脂质体与外泌体的杂化囊泡系统将更有利于药物的精准递送。由于二者均有脂质双分子层结构，因此利用超声、共孵育以及反复冻融的方式可以使外泌体和脂质体发生膜融合。这种杂化囊泡系统使得外泌体易于工程化，而且还具备免疫原性低、稳定性高和循环半衰期长等优势[38]。Lin等[39]从HEK293FT细胞系中提取外泌体，将其融合到脂质体中，利用杂化体成功将CRISPR-Cas9传递到间充质干细胞中。Cheng等[40]研究合成了基因工程外泌体-热敏脂质体的杂化纳米囊泡，该囊泡不仅可以阻断CD47信号，而且具有温度敏感特性，能够有效控制药物释放，实现药物靶向和体内长循环递送的功能，被用于光热联合的肿瘤免疫治疗。Wang等[41]通过机械挤压供体细胞的方式实现了仿生外泌体的大规模生产，一定程度上解决了天然外泌体难以量产的问题，并与具有靶向功能的嵌合肽相连，成功实现溶酶体逃逸和细胞内药物递送的目标。由此可见，对外泌体-脂质体杂化囊泡的进一步研究将有利于药物精准递送和个性化医疗的发展。
综上所示，脂质体和外泌体等纳米囊泡在作为药物载体治疗疾病方面虽有不足之处，但均具备作为药物载体的优势，同时也为仿生纳米囊泡的开发和利用提供了借鉴思路，相信未来通过更深入地研究和更先进地技术对其进行改造，纳米囊泡在药物递送方面将展现出更好的应用前景。
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