先天性巨结肠(Hirschsprung's disease，HSCR)又被称为"无神经节细胞症"，是小儿常见先天性消化道畸形之一，其在新生儿中的发病率约为1∶5 000^[1,2]。HSCR具有高遗传率(>80%)、明显性别差异(男女发病比例约为4∶1)等复杂的遗传特征^[3]。HSCR的发生是由于肠神经嵴细胞(enteric neural crest cells，ENCCs)在远端肠管的迁移、增殖、分化、存活等发生异常而引起远端肠管神经节细胞缺如，导致病变肠管持续痉挛性收缩，蠕动消失，近端肠管被动扩张，从而出现腹胀、呕吐以及排便障碍等临床表现，但其具体发病机制仍未完全阐明^[4,5,6]。术前诊断HSCR的方法主要包括腹部X线检查、钡剂灌肠、肛门直肠测压等，其诊断的金标准是在临床表现及影像学检查的基础上进行病理活检，检测黏膜下神经丛或肠神经组织丛内是否缺乏神经节细胞，及是否伴有黏膜下层神经纤维增生^[7]。

根据肠道中无神经节细胞段所累及的长度，国际上将HSCR分为四型：短段型(short segment HSCR，S-HSCR)、长段型(long segment HSCR，L-HSCR)、全结肠型(total colonic HSCR，TCA)和全肠型(total colonic and small-colon aganglionosis，TCSA)^[8]。由于病理活检属于有创操作，所以很多国内外学者都在探索HSCR的分子机制，以期为HSCR带来新的诊治方法。多组学是指把基因组学(deoxyribonucleic acid，DNA)、转录组学(ribonucleic acid，RNA)、蛋白质组学(蛋白质)、代谢组学(下游的小分子代谢产物)和表观遗传组学(基因表达的广泛变化)等多个组学技术得到的数据集进行生物信息学分析后，将存在差异的组学特征进行整合，从而对疾病进行整体分析的方法^[9]。多个组学数据的结合可以更全面地将HSCR患者基因水平改变、基因表达调控以及蛋白质表达差异等联系起来，对阐明HSCR的发生、发展机制以及早期筛查、诊断及治疗HSCR具有重要意义。

ENCCs迁移停滞是引起HSCR的内在原因，整个过程由神经嵴和肠道微环境的特定信号通路分子和转录因子调控，任何编码这些分子的基因发生突变，都可能影响到整个ENCCs的定植过程，成为HSCR的致病基因^[10]。研究发现HSCR是由多基因异常导致的复杂遗传性疾病，表明对该疾病的基因组学研究是深入了解其发病机理的重要手段^[3]。基因组学是对生物体全部DNA序列进行研究的学科，以DNA变异为主要研究内容，在临床研究中，主要是探讨疾病DNA变异位点及其对生物体的影响，以更好地反映疾病的遗传基础。目前国内外已有很多研究通过全基因组测序或全外显子组测序等二代测序技术绘制HSCR相关的基因组变异图谱，筛选出新的易感基因，并通过生物信息学分析过滤各种遗传变异，鉴定出与HSCR发病相关的显著突变基因。目前已知至少有20个基因与HSCR的发病机制相关，包括RET基因重排、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、GDNF家族受体α1(GFRα1)、NRTN、EDNRB、EDN3、PHOX2B、SOX-2、SOX10、DLL3等^{[11,12,13,14]}。近年来，国内外学者利用第二代测序技术发现了十余个新的HSCR候选基因，包括TBATA、ERBB2、ERBB3、BACE2、DEND3、NUP98、NCLN、PTK2、ITGB4、ACSS2、ENO3、URB4等基因^{[15,16,17,18,19,20]}。除了筛选新的候选基因外，研究者们还致力于寻找已知致病基因中的新致病位点。有学者通过第二代测序技术发现HSCR的主要易感基因RET的14号外显子出现了一个新的无义突变c.2599G>T，并且经过功能学检测证实该突变是具有功能的有害突变^[21,22]。之后又有学者通过相同方法发现HSCR的另一个主要致病基因EDNRB新的重复突变c.367delinsTT(p.L123Fter32)，并推测该突变可能对HSCR具有致病性^[23]。研究显示，目前所知的基因突变只能解释约50%的家族性HSCR病例和20%左右的散发性HSCR病例^[24,25]。上述研究说明，在HSCR中还存在许多未知的潜在致病基因，或已知致病基因的新突变位点还没有被发掘。随着第二代测序技术的迅速发展，利用第二代测序技术可在HSCR患儿中发现更多新的HSCR相关基因突变，但更重要的是，除了进行突变基因的检测外，我们还应该关注突变的功能测试，从而辨别突变是否有害。通过结合基因组学技术以及遗传分析技术，整合多个关键基因的遗传变异与HSCR的关系，可进一步阐明HSCR的遗传机制。除此之外，第二代测序技术可能逐渐成为HSCR等许多出生缺陷疾病的常规产前诊断方法，但若使用基础广泛的遗传学方法，可能发现某些与易患不相关癌症或者退行性疾病相关的基因缺陷，这使得数据分析变得复杂，且增加了经济负担。所以，如何利用靶向的下一代测序方法促进定向基因检测以识别有效的HSCR遗传风险，从而降低基因分析成本和提高解释遗传数据的能力，值得继续研究。

转录组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录及转录调控规律的学科，是细胞中基因转录所得产物RNA的集合。根据RNA是否通过编码蛋白质发挥生物学功能，将其分为编码RNA(messenger RNA，mRNA，占1%～4%)和非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA，>95%)。目前已有大量研究证实RET、GDNF、GFRA1、EDNRB、EDN3、SOX-l0、SEMA3C、PHOX2B、ACCS2、UBR4等基因与HSCR的发生有关^{[26,27,28,29,30]}。如果这些基因的转录表达及其转录调控发生异常，则编码蛋白的结构可能发生改变，导致ENCCs因过早分化或凋亡而不能到达远端肠道，最终导致HSCR^[31]。近年来，国内外不少学者通过转录组测序揭示HSCR病变组织与正常组织的差异性表达。有研究报道在EDNRB^m1yzcm小鼠中内皮素信号通路成员的修饰基因L1CAM表达明显增高，而与胚胎发育密切相关的SHH基因表达显著降低，提示EDNRB/EDN 3信号通路与SHH基因之间可能存在未知的相互作用^[32]。还有学者在HSCR扩张段和狭窄段结肠组织中发现CCL5基因上调，且富集分析发现CCL5参与朊病毒疾病途径，推测CCL5可能通过对神经系统的影响参与HSCR的发生，但该预测结果还未进一步验证^[33]。此外，有学者在HSCR患儿病变肠组织中发现了5个lncRNA与正常结肠组织相比具有显著差异表达性，对于区分HSCR组织与正常组织具有较高的灵敏度和特异度，他们还发现lncRNALOC101926975及其与细胞增殖和胚胎发育高度相关的靶基因FGF1在病变肠管表达下调，该结果可影响肠神经嵴细胞的增殖和细胞周期^[34,35]。而Huang等^[36]也通过相同方法，确定了5个在HSCR中显著上调的circRNAs，并利用这些circRNAs构建了一个circRNA-miRNA-mRNA调控网络，该网络揭示了circRNAs在HSCR中作为靶向miRNA和mRNA的分子海绵潜在功能。还有学者通过对HSCR患儿的血液标本行miRNA测序后筛选出3个与正常血液标本相比具有差异表达的miRNA，包括miR-382上调、miR-29B2和miR-29A下调，并通过KEGG富集分析发现：miR-382主要富集于PI3K-Akt通路，miR-29A富集于癌症中的蛋白聚糖和Hippo信号通路，miR-29B2则富集于细胞周期通路，这些具有诊断价值的miRNA可以作为HSCR新的非侵入性诊断标志物^[37]。上述研究是近年来国内外学者在组织或血液等标本上进行RNA测序发现大量与HSCR相关的编码RNA与非编码RNA，这些研究对深入阐明HSCR的发病机理具有重要作用。而除了疾病机制的研究外，转录组学技术在HSCR新的模型构建中也有重要作用。最近有学者通过苯扎氯胺(Benzalkonium chloride，BAC)灌肠的方式建立HSCR小鼠模型，对BAC小鼠和正常小鼠结肠组织进行RNA测序分析，并与HSCR患儿病变段组织RNA测序结果比较，发现BAC小鼠和HSCR患儿的转录组谱具有相似基因表达^[38]。结果表明：通过BAC灌肠建立的HSCR动物模型简单可行，丰富了现有的HSCR动物模型，对研究HSCR的病理机制和评估新的诊断和治疗方法具有重要作用。而Kuil等^[39]通过对5dpf斑马鱼全肠道进行单细胞RNA测序，发现了11种肠神经系统亚型，并且发现斑马鱼幼鱼具有表达her4、cx43、s100b的胶质细胞，说明可以在5dpf的斑马鱼幼鱼肠道中检测到以前未被识别的神经元和胶质细胞群，该研究扩展了我们对斑马鱼ENS组成和特征的理解，这对研究ENS发育失调所致的HSCR具有重要意义。从以上研究中可以看出，转录组学在揭示HSCR基因表达差异以及疾病模型构建等方面发挥了重要作用，除了对mRNA水平的研究已经取得一定进展以外，越来越多学者也注意到非编码RNA在HSCR中的重要作用，但目前大多数研究主要关注异常转录产物以及转录表达的调控关系，而对其体内外功能的研究报道较少。虽然RNA测序技术可筛选出新的差异表达基因和相关分子信号通路，但对这些候选基因(尤其是许多非编码RNA)与HSCR的具体关联和机制仍不清楚，未来我们需要对这些候选基因进行表达验证及体内外功能验证，梳理清楚相应RNA与靶基因之间的调控关系，进一步探究HSCR发生、发展的新机制。

蛋白质是直接参与生命活动的生物大分子，蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，其作为细胞连接基因表达与表型的主要"功能层"^[40]。由于泛素化、甲基化、磷酸化等翻译后修饰的存在，mRNA水平并不总是与蛋白表达或活性相对应。而与转录产物相比，蛋白质是直接的功能参与者，所以比起基因组学和转录组学，蛋白质组学在揭示各种生理和病理过程中的关键分子和途径上更具优势，其研究的核心在于蛋白质的分离与鉴定，主要步骤为双向电泳和质谱分析^[41]。近年来，蛋白质组学主要用于识别可能与HSCR相关的蛋白质水平比较表达谱，不少学者利用双向电泳和质谱分析技术分析HSCR患者狭窄结肠段组织和正常结肠段组织之间的差异蛋白质组模式。有研究者发现在病变的狭窄组织中大约有12种蛋白(GST、ACTN4、HSP90B1、HSPB1、APOE、PRDX、BMPR1A、MYLIP、α-辅肌动蛋白、白蛋白、Hsp27和GSK3b)表达上调，5种蛋白(FABP7、TAGLN 、原胶原－脯氨酸、Wnt1和PRDX3)表达下调^[42,43]。有学者通过改进方法后对HSCR患者无神经节段和正常后肠组织蛋白质表达差异进行了研究，分析确认了HSPB 1、CNN 1、ANXA2和ATP5B等四种调控平滑肌运动的差异蛋白以及SOX10、纤维蛋白原(Fn)、FHL 1、TAGLN和AGR2等五种HSCR病理相关的差异蛋白，这些蛋白的异常可能影响细胞-ECM附着物组装、细胞增殖和细胞迁移等过程，从而导致HSCR等ENS疾病^[44]。以上研究主要的技术缺陷是只能检测到丰度较高的蛋白质，而丰度较低的蛋白质不能被分析到，所以可能无法全面地揭示HSCR的发病机制。后来，有学者使用串联质量标记进行基于质谱的蛋白质组学分析，并利用生物信息学分析对不同性别、不同亚型的HSCR结肠组织蛋白质组学数据进行分析和分类，发现正常肠道组织中蛋白质的丰度和表达模式在不同性别间存在较大差异，ARF4、KIF5B、RAB8A等三种神经元投射发育相关蛋白在HSCR患者狭窄结肠段组织中的表达下调，而男性L-HSCR与女性S-HSCR具有相似的异常蛋白表达模式(程度)，并且这些差异表达蛋白主要在剪接体(mRNA剪接)、轴突导向、胞外外泌体、胞浆和蛋白结合等方面发挥作用，并且对剪接体、碳代谢、轴突引导、内吞和黏附连接等信号通路有显著影响，这些发现可能为进一步研究人类ENS发育的分子机制提供有价值的信息。从以上研究可以看到蛋白质组学除了可以检测HSCR患儿与非HSCR患儿之间的差异表达蛋白外，对于揭示这些差异蛋白与不同信号通路之间的潜在关联也具有重要作用，但是，这些研究并没有阐明这些分子的功能障碍在HSCR中的具体调控机制(如何破坏神经元发射投育、怎样增加HSCR的风险等)，未来还需深入挖掘。

除了上述三大主流组学研究外，HSCR的表观遗传组学以及代谢组学近年也逐渐成为研究者们的关注领域。

表观遗传学是指在不改变DNA序列的情况下，通过不同的机制调节基因表达，包括胞嘧啶碳碱基上的DNA甲基化和调控非编码RNA表达等方式。近年来表观遗传学在HSCR发生机制中的研究也逐渐增多，有学者证实甲基转移酶3B(DNMT3B)在HSCR患者神经嵴细胞中的下调与整体DNA甲基化水平的降低有关^[45]。本团队前期研究也发现，在HSCR患儿无神经节细胞段肠管中，MEG3启动子甲基化率高于有神经节细胞段肠管，表明HSCR中MEG3表达异常可能源于其启动子甲基化率升高^[46]。这些研究结果均说明DNA甲基化在肠神经系统的发育和HSCR发病中起关键作用，而除了DNA甲基化以外，在组蛋白修饰以及非编码RNA调控等方面也有不少研究。这些研究对构建出HSCR中表观遗传调控网络并说明其与遗传学的交叉作用等方面具有重要意义。

代谢组学是一门研究各种代谢物的新兴学科，旨在对生物样品中的所有代谢物进行全面、定量的分析，找出代谢物与生理、病理变化之间的联系。主要方法有气相色谱－质谱和液相色谱－高分辨率串联质谱。目前，环境因素对HSCR易感性的影响也成为了研究者们新的研究方向。近年来，先后有人报道代谢酶CYP2B6以及前列腺素合成酶mPGES-1因为调节肠神经嵴细胞的迁移而与HSCR的发病机制有关。还有研究者发现HSCR的代谢谱主要与色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的代谢有关，并且提出色氨酸代谢紊乱可能是HSCR的一个重要代谢特征。虽然上述研究都阐述了环境因素对HSCR的显著易感性影响，丰富了现有的疾病发生机制学说，但目前HSCR的代谢组学研究尚处于较浅层面，未能深入阐明其潜在的机制，未来仍需要继续探索。

综上，当前HSCR的研究大多局限于基因、蛋白等单一层面水平，而HSCR是一个多组学改变导致的过程复杂、分子网络庞大的疾病，并且没有任何孤立的组学分析可完全阐述HSCR病因以及发病机制。因此，在未来的研究中我们不能只停留在单一的组学层面，需要整合多组学数据，对HSCR的发病机理、分子机制、因果关系等做出深层次的阐释，为HSCR的预防、诊断及治疗提供新的途径。