乙型肝炎已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行广泛、危害性严重的传染病之一。据《中国卫生健康统计年鉴（2022）》数据显示，2021年，我国乙型肝炎发病率为69.25人/10万人。为了使感染科临床工作者获得乙型肝炎研究的前沿信息，本文对乙型肝炎的靶点和新型诊断标志物与病毒复制的相关性、临床意义及检测技术改进等作了重点介绍，建议有条件单位逐步扩大检测，这将对临床诊断率及抗病毒药物评估有帮助，并有助于实现世界卫生组织提出“到2030年乙型肝炎诊断率要提升至90%”的目标。
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乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染为世界性流行，据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报道，2019年全球一般人群HBsAg流行率为3.8%，约有150万新发HBV感染者，2.96亿慢性HBV感染者，82万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等相关疾病［1, 2］。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是一种持续存在于肝脏中的HBV感染，其原因是HBV感染肝细胞后，病毒基因组在细胞核形成共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），并以微染色体（minichromosome）的形式长期存留于细胞核内，乙型肝炎的抗病毒治疗需长期服药，停药后HBV DNA通常出现反弹［3］。距离实现WHO提出“到2030年乙型肝炎诊断率需提升至90%及治疗率提升至80%”的目标存在巨大差距。目前我国乙型肝炎诊断率只有22%，治疗率仅15%。因此，临床上乙型肝炎血清学标志物检测的需求不断增加，其在疾病诊断及抗病毒药物疗效的评价中均有重要参考价值。
HBV属嗜肝部分双链DNA病毒，是病毒颗粒包膜的双层脂质，包含大、中、小表面蛋白。负链HBV DNA基因组是在将前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）和HBV聚合酶共同包装在20面体核衣壳内后，通过反转录合成。在感染宿主细胞后，核衣壳在细胞核中分解，释放出松弛的环状DNA（relaxed circular DNA，rcDNA，为3.2×103 bp），此基因组被转运至细胞核；利用宿主DNA修复机制，rcDNA被修复形成cccDNA。以cccDNA为模板转录成4种RNA，包括3.5×103 bp的pgRNA和3种亚基因组RNA（2.4×103 bp 的preS1、2.1×103 bp的preS2和700 bp的XRNA）。这些RNA能产生7种蛋白质，即pgRNA翻译的核心蛋白和聚合酶；前核RNA翻译的分泌型e抗原（HBV e antigen，HBeAg）；XRNA翻译的HBVX蛋白（HBV X protein，HBx）；preS1 RNA翻译的大乙型肝炎表面抗原（large-HBV surface antigen，L-HBsAg）；preS2 RNA翻译的中乙型肝炎表面抗原（middle-HBV surface antigen，M-HBsAg）和小乙型肝炎表面抗原（small-HBV surface antigen，S-HBsAg）。细胞质中HBc将pgRNA和病毒聚合酶包裹起来，形成新的病毒衣壳。其中被修复的cccDNA微染色体，能长期存留于细胞核内，是HBV感染慢性化和逃避清除的重要分子基础［3, 4, 5］。
pgRNA被包装在核衣壳内，并反转录成负链HBV DNA开始复制。HBV cccDNA可作为pgRNA和亚基因组mRNA转录的模板，编码大、中和小表面蛋白、前核心HBeAg与核心蛋白、聚合酶蛋白，以及X蛋白。HBV显示了4个开放阅读框（线性描绘），以及来自整合的HBV DNA 和 cccDNA 的 HBsAg 的双重来源。还显示了源自cccDNA和整合病毒基因组的mRNA转录本。列出的蛋白质产品-血清中的生物标志物，包括HBsAg、HBeAg、HBV RNA 和乙型肝炎核心相关抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg），以及未转录的pgRNA也能分泌出来。聚合酶开放阅读框编码大聚合酶和核心蛋白，乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）和HBeAg是前核-核心开放阅读框的两种翻译产物，它们共享同源氨基酸序列，但具有不同的性质。核心蛋白在核衣壳中组装。来自上游起始密码子的翻译和来自前核心蛋白的加工产生HBeAg，这是一种分泌到血清中的可溶性二聚体蛋白。由前核区编码的额外29个氨基酸中的前19个氨基酸作为信号肽，将核心-核心蛋白引导至分泌途径。2.4×103 bp pre S1 mRNA 转录物编码LHBs 蛋白，2.1×103 bp pre S2/S mRNA编码中表面 HBV（MHB）蛋白和小表面（SHB）蛋白，700 bp X mRNA 编码X蛋白。cccDNA的转录物显示有一个共同的多聚腺苷酸化位点。来自HBV整合的S转录本表明染色体DNA的转录。cccDNA的转录物显示有一个共同的多聚腺苷酸化（polyadenylation）位点，即指多聚腺苷酸（polyadenylic acid）与mRNA分子共价链结的共同位点（图1）［6］。
注：Integrated HBV DNA.整合的HBV DNA；subgenomic RNAs. 亚基因组RNAs；HBV open reading frames. HBV开放阅读框；RNA transcripts. RNA转录产物；HBV virion. HBV病毒粒子；Subviral particles. 亚病毒颗粒；PgRNA.前基因组RNA。
首先必须重点阐明HBV核心蛋白的功能、pgRNA的包装、逆转录与核衣壳的作用等概况［7, 8］。HBV核心蛋白是一种结构蛋白，最主要的功能是自组装形成HBV核衣壳，其组成具有重要的生物学特性和功能。在T淋巴细胞和B淋巴细胞水平上抗原性较HBeAg更为重要，因此，衣壳组装调节剂（CAM）或核心蛋白变构调节剂（CpAM）已成为治疗乙型肝炎新药开发中重要的一环。每个二聚体通过弱疏水作用与4个相邻亚基结合，最终组装成的核衣壳为20面体［7］。组装成的核衣壳分为两种类型：多数是由240个HBV核心蛋白（即120个同型二聚体）组装而成；少数核衣壳的尺寸较小，含有180个HBV核心蛋白（即90个同型二聚体）。在乙型肝炎患者体内，这两种颗粒均存在，其中体积稍大的颗粒占多数。N端结构域（NTD）对于同型二聚体之间的组装连接是必需的，而即使从HBV核心蛋白中删除C端结构域（CTD），核衣壳组装也不会受到影响。虽然核衣壳组装不需要CTD，但后者仍然涉及许多其他功能。NTD和由超螺旋的HBV cccDNA分子转录的pgRNA离开宿主细胞核，并在细胞质中结合反转录酶，最后包装到核衣壳中，即衣壳化。核衣壳内HBV核心蛋白的CTD对于pgRNA衣壳化是必须的。体外研究表明，缺乏CTD的HBV核心蛋白不会包裹pgRNA［9, 10］。pgRNA反转录为rcDNA包含多个步骤：模板转换、引物易位和DNA延伸，这些步骤均发生于衣壳内。HBV核心蛋白上的CTD参与rcDNA的合成，当这种富含精氨酸的结构域CTD发生突变时，rcDNA不能合成。成熟的核衣壳与定位于内质网后、高尔基复合体前腔的HBsAg结合后，形成完整的病毒颗粒从核糖体释放出来。HBV核心蛋白负责选择成熟的核衣壳，即含有rcDNA包膜的核衣壳。rcDNA也可转移回宿主细胞核进行再循环，以补充cccDNA库。从核衣壳释放的rcDNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，又转化为HBV cccDNA。
传统的HBV DNA和血清学标志物的检测水平尚不够理想，如HBsAg检测难以区分来源于cccDNA的HBsAg和来源于整合病毒基因组的HBsAg。又因cccDNA尚缺乏公认的定量检测标准等，无法准确反映cccDNA转录活性，并且阻碍了低病毒血症患者的检出率及抗病毒药物疗效的评价。为此，研究者陆续开发出新型HBV血清学标志物［11, 12］，如HBV RNA、定量HBsAg（quantitative HBV surface antigen，qHBsAg）、HBcrAg及HBV大表面蛋白等。基于不同标志物在疾病诊断中的不同参考价值，近年来，临床对血清学标志物定量检测和HBV DNA高敏检测的需求不断增加，同时，有关HBV全新标志物如pgRNA和HBcrAg应用的报道也陆续出现。HBV标志物主要用于临床实践中诊断HBV感染、监测疾病进展、评估治疗应答，以及在临床试验中评估新型抗病毒药物的疗效。其中生物标志物除HBV DNA定量外，大部分HBV定量标志物尚未纳入我国检验室间质量评价（external quality assessment，EQA）体系评价，如qHBsAg、HBcrAg和HBV pgRNA，目前只能按国际定量标准品评估。推广应用国际标准品，有助于提高结果的量值溯源性和不同实验室间结果的可比性。
随着HBV新治疗靶点的发现，HBsAg阴转已成为CHB功能学治愈的主要目标。从分子病毒学研究到监测CHB疾病进展和疗效预测等方面，新的观念不断涌现［12］。qHBsAg检测对于未治疗的 CHB 患者具有主要临床意义，特别是低病毒载量的 HBeAg 阴性患者，qHBsAg检测可了解疾病进展并监测预后。qHBsAg反映肝细胞内cccDNA数量或转录活性，也反映免疫系统对HBV的控制力，还可预测HCC发生，低病毒载量HBV DNA（<2 000 IU/mL）的HBeAg阴性慢性感染者，qHBsAg>1 000 IU/mL是HCC发生的高危因素。HBsAg<1 000 IU/mL联合HBV DNA < 2 000 IU/mL区分非活动性HBsAg携带状态和HBeAg阴性CHB的准确性为78%。监测HBsAg又可帮助决定对核苷（酸）类似物［nucleos（t）ides analogues，NAs］和其他抗病毒药物应答评估，是否应更换药物或继续治疗。当前化学发光技术的HBsAg试剂，其最低检测限（limit of detection，LOD）一般为0.05 IU/mL，而高灵敏HBsAg试剂LOD可达0.005~0.0005 IU/mL，其应用有助于进一步缩短急性HBV感染的诊断窗口期，提高隐匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）的检出率，但也对“临床治愈”的标准提出了新挑战。OBI患者HBsAg通过传统检测方法可以阴性，但血清或肝脏活检仍可检测到HBV DNA。新一代高灵敏HBsAg检测方法有雅培的ARCHITECT HBsAg Next检测法（HBsAg NEXT），其检测下限为0.0052 IU/mL，是传统检测方法的2~18倍。
HBV cccDNA是基因产物转录的模板，主要存在于宿主细胞核中。从理论上讲，抑制cccDNA形成的方式有两种，即阻断HBV感染和抑制rcDNA修复形成cccDNA。国内外学者进行了大量探索，建立多种检测HBV cccDNA的方法，但因特异度和敏感度等问题，未用于临床。最近将巢式聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）与实时荧光定量PCR相结合，建立一种特异、灵敏的巢式-实时荧光定量PCR方法，用于CHB外周血单个核细胞和血清标本中HBV cccDNA的检测，为研究HBV复制、评价抗病毒药物疗效。患者血清、单细胞和组织样本中 cccDNA的检测，可釆用微滴—数字PCR（droplet-digital PCR，ddPCR）检测［13］，肝活检组织应釆用一种恒温扩增方法——滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）与实时 PCR 相结合的方法检测。一种基于RAA-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒己在临床或科研中应用［14］。
盘踞在肝细胞核中的cccDNA可转录出4种不同长度的mRNA（分别为（3.5、2.4、2.1、0.7）×103 bp，其中3.5×103 bp长的mRNA含有HBV DNA序列上全部遗传信息，称为pgRNA。pgRNA被HBcAg构成的核衣壳所包裹存在于病毒颗粒中，释放到细胞外。在HBV复制过程中可有少数pgRNA未启动逆转录，而直接装配成HBV RNA病毒颗粒进入外周血，其过程不为NAs所阻断。所以检测出的HBV RNA，即pgRNA及其剪接变体和3’端截短体等。因此，HBV pgRNA在外周血水平可反映出cccDNA的转录活性，研究证实也是临床应用的基础［15, 16］。需要指出的是，HBeAg阳性患者其HBV RNA水平明显增高；而在HBeAg阴性患者中，HBV RNA水平则与HBsAg水平之间的相关性较差（因为HBsAg来源于整合基因组）。然而，目前对HBsAg检测并不能区分来源于cccDNA的HBsAg，还是来源于整合病毒基因组的HBsAg，这是乙型肝炎慢性化的主要原因。值得注意的是，在慢性HBV感染的治疗中，HBV pgRNA颗粒的含量，与抗病毒药物应用或停药呈正相关，因而HBV RNA比HBsAg的检测更能准确反映cccDNA的活性［17］。由于乙型肝炎标准治疗NAs对cccDNA转录为pgRNA的影响极小，因此在乙型肝炎治疗过程中HBV RNA的可检测时间会长达数年。
我国建立了血清HBV RNA检测的国家标准品（批号：340008-201901），实现了定量检测试剂的可比性和可溯源性。国内首个血清pgRNA荧光定量检测试剂盒于2022年11月15日获国家药品监督管理局批准上市［18］。
HBcrAg涉及HBeAg、HBcAg及p22cr蛋白。血清HBcrAg检测可作为CHB血清学转换的替代标志物，可反映肝内病毒复制活性，能准确区分HBeAg阴性感染和活动性CHB［19］。HBcrAg由HBV前C/C区编码的HBcAg、HBeAg与人P22cr蛋白（P22cr）3种蛋白质组成（共享C基因编码的149个氨基酸序列），其中P22cr是HBeAg形成前的中间产物，包含从-28~150的氨基酸序列的一种前核心蛋白，包括未剪切的信号序列，但缺少C末端的精氨酸富集区域，常存在于空缺的、不含病毒核心的病毒颗粒中。队列数据显示，对于接受抗病毒治疗的HBeAg阴性的“灰区”患者，HBcrAg可对HCC和/或肝硬化风险进行分层，但需要通过高度专业化的方法进行检测。采用手动样品预处理过程的HBcrAg定量检测方法（lumipulse G HBcrAg）已显示落后，需要高度专业化的方法。目前科学家们已经开发了一种更为高灵敏度的血清HBcrAg检测技术—化学发光酶免疫分析法（CLEIA），称为iTACT-HBcrAg，发现与HCC发生显著相关，其检测下限可达2.1 lg U/mL。iTACT-HBcrAg测定法是一种两步夹心CLEIA，采用主板样品预处理工艺，所有评估均在Lumipulse® L2400分析仪（Fujirebio，Inc.）上进行［20, 21］。此法的优点：（1）可在抗HBV治疗期间血清HBV DNA检测的临床病例中检出。操作方便、样品预处理时间更短、灵敏度更高。其灵敏度（2.1 lg U/mL）大约是G-HBcrAg（2.8 lg U/mL）的10倍。（2）有助于监测HBV再激活，作为HBV DNA的替代方法，对HBV感染后的随访和CHB患者的监测非常有用。（3）有助于判断近期可能开发靶向新药的治疗效果［22］。
抗-HBc是HBV感染后由HBcAg刺激B淋巴细胞，可以在不需要T淋巴细胞辅助的情况下产生的一种非保护性抗体。抗-HBc IgM在HBsAg阳性后2~4周出现，为HBV急性感染及慢性感染病情活动的标志。抗-HBc IgG出现较迟，但长期存在10~20年，甚至终身维持阳性，是现症或既往感染的标志。在HBsAg阴性的个体，其阳性也提示可能存在OBI，因此，对此血清标志物未能引起临床者重视。近来研究发现其定量检测有新的意义［23, 24］，有望替代丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）成为反映肝脏炎症的更敏感指标，也有望成为预测干扰素及NAs抗病毒疗效的新指标。如上述结果能获得证实，将对慢性HBV感染的诊疗起到重要作用。对其结果意义要重新评估，主要表现在以下几方面：（1）HBV的存在是激发和维持抗-HBc的关键所在，是提示HBV现症感染的存在，其诊断意义优于HBsAg。诊断HBsAg阳性慢性感染者，抗-HBc的界值为89 IU/mL；而诊断HBsAg阴性隐匿性感染者，抗-HBc的界值为6.6 IU/mL。（2）抗-HBc水平高低能反映患者对HBV的免疫状态和肝脏炎症程度；（3）当ALT<5倍正常值上限（ULN）时，抗-HBc水平与ALT有较强的相关性，提示HBcAg出现持续时间短暂，仅发生在机体免疫清除的早期。（4）抗-HBc定量水平和肝组织纤维化程度呈正相关。检测方法用酶联免疫吸附测定（ELISA）法直接稀释标本的核心抗体易造成假阴性。建议釆用原倍血清应用时间分辨荧光免疫法（如PerkinElmer诊断HBcABⅡ定量试剂盒）。
HBV标志物可用于诊断感染、监测疾病进展、评估治疗应答及新型抗病毒药物临床试验中的疗效观察等。中华医学会肝病学分会制订《乙型肝炎病毒标志物临床应用专家共识》旨在对经典及新型HBV实验室检测相关标志物进行规范的指导与合理应用的推荐［9］。本文作者在学习共识的同时，对5种HBV血清标志物从病毒复制的相关性、临床意义及检测技术改进等进行探讨，并建议有条件单位增加新型HBV标志物项目的检测。
马亦林. 慢性乙型肝炎新型诊断标志物的研发概况［J］. 中华临床感染病杂志，2024，17（2）：93-98. DOI：10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2024.02.002.
作者声明不存在利益冲突
