目前进展期胃癌的5年生存率仍然低于40%，复发率居高不下，其中腹膜转移（peritoneal metastasis，PM）是最常见的复发类型^［1］。研究认为腹腔游离肿瘤细胞（free intraperitoneal tumor cells，FITC）与患者的预后及治疗结局有关^{［2, 3］}。国际抗癌联盟（UICC）和美国癌症联合委员会（AJCC）联合出版的第八版TNM分期将腹腔脱落细胞学阳性定义为肿瘤M1期^［4］。然而如何快速准确地检测FITC成为胃癌诊疗的难点问题。在临床实践中，越来越多的检测技术被开发利用，本文就胃癌FITC检测方法及其临床意义相关问题进行文献复习。

腹水或腹腔灌洗液细胞学检查是目前诊断胃癌FITC的金标准，虽然敏感性比较低，但是有助于发现肉眼无法识别的微转移。FITC是形成PM的先决条件，是胃癌独立的预后不良因素，一旦阳性，可确诊Ⅳ期胃癌。为减少手术操作引起癌细胞脱落的情况，腹腔细胞学冲洗应遵循规范进行操作，使用250 ml以上的温生理盐水按一定顺序冲洗腹腔，避免直接冲洗原发病灶，注意保护浆膜面。冲洗顺序可从双侧膈顶、肝上、肝下、大网膜、双侧结肠旁沟到子宫-膀胱直肠陷凹，于双侧膈下区、肝下区和道格拉斯窝收集100 ml的灌洗液送检。如果有足够量腹水（200 ml以上），也可直接取腹水送检。收集完腹水或腹腔冲洗液后，尽快送病理科染色镜检，及时反馈结果给临床医师，以便进行临床决策^［5］。日本胃癌协会于1999年首次将腹腔细胞学结果作为胃癌分期指标之一，并纳入TNM分期^［6］。目前UICC、AJCC、中国抗癌协会胃癌专业委员会已将腹腔脱落细胞学阳性定义为肿瘤TNM分期M1期^{［4, 5］}。但腹腔细胞学检测隐匿性PM的灵敏度为26.0%~70.8%，这可能与操作不规范、细胞病理学检测方法敏感度低等有关^［7］。为提高确诊率，进展期胃癌（cT2~4、任何N和M期）可采用腹腔镜检查，主要用于治疗前的诊断、术前治疗后的疗效评价，并同时进行FITC检测^［5］。细胞学检查与诊断性腹腔镜联合应用可作为术前影像学检查的补充，在精准分期、治疗方案选择、预后判断等方面具有重要价值，避免不必要的开腹和关腹手术^［8］。一项日本的前瞻性研究纳入BorrmannⅢ型或Ⅳ型或影像学可见肿大淋巴结的无症状胃癌患者156例，采用腹腔镜探查+FITC检测，有47%的患者因发现隐匿性PM而改变了初始治疗策略^［9］。由于细胞学检查的液体样本细胞沉淀少、细胞群的异质性以及肿瘤细胞含量较低，含有大量反应性间皮细胞和炎症细胞，导致难以检测到相对较少的肿瘤细胞，因此，腹腔细胞学检查对肿瘤诊断和分型的能力相对较低，诊断敏感性低且宽泛。细胞蜡块技术是将浆膜腔积液的样品离心，细胞和微小组织块被高度浓缩后用固定剂凝聚、石蜡包埋再制成切片。除可在光镜下观察癌细胞形态外，还用于免疫细胞化学和基因检测等，对细胞的良、恶性和组织学类型及癌细胞来源的诊断和鉴别诊断有一定帮助，可提高病理诊断敏感性^［10］。它与传统细胞学制片方法相比具有明显的优势，能较好地展示细胞排列方式，有助于组织学分型，细胞染色清晰，能长期保存，切片重复性好，适合进行免疫组化（immunohistochemistry，IHC）检查等。因此，该方法在肿瘤病理诊断上应用前景良好^［11］。

1941年，Hidalgo^［12］首次报告了IHC技术，证明比传统细胞学检测率提高了14%^［13］。基本原理是抗原-抗体反应，石蜡切片IHC是其最常用、最基本的方法，具有组织形态保存好、连续切片、长期存档等优点。然而，IHC技术也同样存在灵敏度宽泛、准确度差等缺点（22.1%~75.0%）^［14］。

尽管FITC阳性患者复发风险增加，但部分患者仍然能够从常规化疗中受益，这种异质性使得患者的精准治疗扑朔迷离。2018年，日本Watanbe等^［15］研发的一种能在常规细胞学阳性的胃癌患者中识别生物学恶性亚群的荧光细胞学方法，结合纳米技术，使用一种端粒酶启动子调节病毒复制、表达绿色荧光蛋白的减毒腺病毒感染腹腔灌洗液中提取的游离肿瘤细胞。感染后的减毒腺病毒继续复制即表明被感染的游离肿瘤细胞存在生物活性。随后使用多模式酶标仪对端粒扫描阳性细胞发出的荧光进行定量记录和分析。结果显示，在21例常规细胞学阳性的患者中，使用该方法检测到了14例荧光定量阳性，即具有生物学活性，其预后生存率明显低于7例荧光定量阴性的患者（P=0.006 2），阳性患者中位生存期为235 d，阴性患者为671 d。2019年，Wang等^［16］采用阴性富集免疫荧光原位杂交技术（negative enrichment and immune fluorescence in situ hybridization，NEimFISH）检测出腹腔灌洗液游离肿瘤细胞的染色体8/17突变，结果显示，NEimFISH可以区分所有良性和97%的恶性组织样本，对常规细胞学检测阳性的腹腔灌洗液样本该方法仍然有效，并且比常规细胞学和石蜡病理学检测阳性率更高。因染色体8和17分别与c-myc基因和TPC基因相关，所以NEimFISH技术的检测结果能在一定程度减少假阳性概率，并增加检测结果的准确性。

IHC及免疫荧光技术因其特异性强、敏感性高等优点作为辅助手段能够检测肉眼无法发现的腹腔转移而被临床广泛应用。由于IHC的检测肿瘤细胞过少，且细胞形态学判断的难度大、不同病理医师经验的差异、标准的不统一等均可导致结果判断出现较大差异^［17］。免疫荧光细胞学方法可识别生物学恶性的阳性亚群，为患者的精准治疗提供指导^［15］。然而，该方法需要24 h病毒感染期，难以快速诊断。NEimFISH技术可以降低常规IHC的假阳性率，但是不能识别肿瘤细胞是否具有生物学活性，并且过程繁琐，限制其应用^［16］。

2014年，日本Kitayama等^［18］首次利用流式细胞仪对从胃癌患者腹水和腹腔灌洗液的FITC的相对含量进行了定量分析。将CD326（+）定义为肿瘤细胞（tumor cells，T），CD45（+）定义为白细胞（leukocytes，L），对CD326、CD45进行免疫染色，通过流式细胞仪计算T/L，即游离肿瘤细胞的相对含量（TLR）。结果显示，PM（+）组的TLR显著高于PM（-）组（M=1.39%，0~807.87%比M=0，0~2.14%，P<0.001），在PM（+）的患者中，细胞学法（cytology，CY）（+）患者的TLR高于CY（-）患者（M=2.81%，0.02%~1 868.44%比M=0，0~3.45%，P<0.000 1），并且24例患者接受腹腔内化疗的前后TLR降低比细胞学检测更显著。认为基于流式细胞仪腹腔内CD326（+）/CD45（+）比例（TLR）检测可以作为反映PM严重程度以及腹腔化疗有效性的诊断指标。作者认为TLR极好地反映了腹腔中的肿瘤负担，可以作为确定PM阳性胃癌患者化疗结果和有效性的可靠生物标志物，同时可以预测预后^［19］。

流式细胞仪检测FITC是一种比较新颖的方法，CD45（+）因稳定表达而被选取为参照，然而其表达受多种因素影响，这也影响其最终结果的可信度。目前，仅日本Kitayama团队对流式细胞仪检测胃癌患者游离肿瘤细胞进行过相关报道，因此尚需大规模多中心前瞻性临床研究加以证实。

目前最常用的方法是定量或非定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription /reverse transcription-polymerase chain reaction，QRT/RT-PCR）检测腹腔灌洗液癌胚抗原 mRNA水平，与传统细胞学检查相比，RT-PCR检测FITC的灵敏度及阳性率更高，但是灵敏度的提高往往伴随特异性的降低，假阳性结果成为RT-PCR推广的一个限制因素^{［20, 21］}。此外，基因扩增所需的时间和检测成本也制约了RT-PCR在术中决策时的应用^［22］。逆转录环介导等温扩增法（reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）、一步核酸扩增法（one-step nucleic acid amplification，OSNA）以及转录-逆转录协同反应法（transcription-reverse transcription concerted reaction，TRC）等有望成为补充或替代常规细胞学检测和RT-PCR技术的检测方法。

2014年，Yoneda等^［23］将RT-LAMP技术首次应用于52例胃癌FITC的检测，细胞学阳性患者的预后很差，RT-LAMP阳性的患者比阴性患者预后差，且在细胞学检测阴性的患者中RT-LAMP阳性的患者比阴性患者预后差。2015年，Nakabayashi等^［24］首次评估OSNA技术检测胃癌患者腹腔灌洗液中癌胚抗原 mRNA水平，OSNA的检测结果与RT-PCR呈极高相关性（r=0.998，P<0.01），与常规细胞学检测可达到93.8%的一致率。Gęca等^［25］研究结果显示OSNA检测阳性的患者中位生存期显著低于阴性患者（19个月比45个月，P=0.007 4）。然而，这些研究样本量少，其可靠性和可信度仍需大规模前瞻性临床试验证明。2004年，Shii等^［26］基于RT-PCR技术开发了一种快速检测癌症微转移TRC技术，并验证了该技术在灵敏度和重复性与RT-PCR的一致性，并且比常规RT-PCR简单、快速。他们在一项多中心、前瞻性研究中纳入137例浆膜侵犯胃癌患者，其中104例患者接受根治性手术，结果显示，27例（20%）常规细胞学检测阳性的患者预后较差，而在细胞学阴性的患者中，TRC检测阳性的患者比阴性患者总生存时间更低（P=0.008），且TRC检测阳性的患者在所有137例和104例接受根治性手术的患者中均显示更低的总生存时间，再次检验TRC技术的可靠性和科学性^［27］。Fujita等^［28］在一项多中心、前瞻性研究中评估了TRC检测技术在腹腔镜手术中的临床意义，结果显示，在100例确诊为进展期胃癌并最终接受腹腔镜手术的患者中，通过TRC技术检测22例患者腹腔灌洗液癌胚抗原 mRNA阳性，并最终证明TRC检测阳性患者的总生存时间、RFS等均显著低于TRC阴性患者。

与常规RT-PCR相比，RT-LAMP、TRC、OSNA等改良核酸扩增技术不需要进行变性、退火、延伸等步骤，避免常规RT-PCR对温度和高精度仪器的需求。RT-LAMP因扩增环节的特殊性而具备高特异性、高灵敏度和快速性^［23］。OSNA是基于RT-LAMP技术的改良方法，同样具有快速（30 min）、客观、定量和可重复性强等优点^［29］。TRC仅在单个试管中恒温便可操作，从组织取样到获取诊断结果可在1 h内完成^{［26, 27］}，并且TRC已被多家机构验证^{［27, 28］}。因此，RT-LAMP、OSNA、TRC有望成为替代RT-PCR的潜力技术。尽管RT-PCR及其衍生技术在临床上应用取得了一定进展，但假阳性结果、检测成本、专业性强等仍然限制其广泛推广使用。

2021年，Bae等^［30］首次采用NGS方法对33例消化道肿瘤患者的腹水和腹腔冲洗液细胞学样本进行了检测，与组织样本检出的基因突变进行了比较，发现细胞学样本和组织样本检出基因突变的总体一致性为25%。肿瘤细胞含量>2%的细胞学样本可检出致病性突变，敏感性为69.2%。胰腺癌患者腹水样本分别有33%、13%和7%的KRAS、TP53和CDH1基因突变阳性，胃癌患者腹水样本分别有25%、12%和13%的KRAS、TP53以及APC基因突变阳性。作者认为，根据基因突变情况可以预测肿瘤复发和患者预后，以及确定治疗方案。该方法适合于各种液体活检样本，包括渗出液、脱落细胞和冲洗液样本等，可用于消化道肿瘤患者的分子评估。为了评估腹水细胞学样本NGS检测的临床可行性，需要对更多有腹水的患者进行前瞻性研究。

物理和化学方法拓展促进了细胞生物技术中细胞分离和鉴定技术的发展，如微流控芯片技术等。2020年，Zhang等^［31］首次利用光诱导电动力学结合新型微流控芯片实现了在胃癌患者腹水中快速（分离和收集过程仅需5 min）分离活胃癌细胞。他们利用胃癌细胞和腹腔灌洗细胞在大小和细胞膜电容上的差异建立了细胞极化模型和细胞膜电容的溶液模型，分离收集后细胞学检测结果显示纯度高度71%。最近，Zhao等^［32］使用改良的微流控单细胞捕获阵列芯片（microfluidic single-cell trapping array chip，SCTA-chip）对12例胃癌患者腹水样本进行了游离肿瘤细胞的捕获分析，结果显示该芯片从含1/10 000的癌细胞模拟腹腔灌洗液中成功分离出癌细胞，回收率为84.8%，纯度为72.4%，12例临床腹水样本分离捕获的细胞成分经细胞学证实为癌细胞。SCTA-chip实现了在胃癌患者腹水快速分离活游离癌细胞，具备一定的临床前景，但仍然需要大规模的前瞻性多中心临床试验来验证。而且此种技术仍然处于发展阶段，芯片设计复杂、成本昂贵、能否应对临床各种复杂情况等仍是其亟待解决的问题。

胃癌FITC阳性是一种特殊类型转移，属于晚期表现，治疗效果差，预后不良。细胞学检查仍然是其检测金标准，阳性结果被认为是M1。分子诊断技术应运而生，RT-PCR及其衍生改良的技术大大弥补了细胞学敏感性的不足，甚至同时具备快速性、客观性、灵敏度和特异性。然而各种分子诊断技术对专业技术人员、诊断设备要求较高，高灵敏度的同时往往存在一定的假阳性率，并且不同机构之间分子诊断的标准存在差异。分子诊断的缺点也是其检测阳性结果无法成为影响最终肿瘤分期因素的原因之一。近年来，微流控芯片技术走入了临床试验和实践中，然而此种技术仍处于发展阶段，各种问题亟待解决。

综上所述，FITC检测有利于发现“隐匿性”、“亚临床”、“微转移”病灶，虽然分子生物学技术的应用提高了检测的灵敏度，但目前所用方法尚难以普及，更迅速、更敏感、更加精准的检测方法仍需进一步探索。