本文报道1例新型冠状病毒肺炎(COVID-19)感染后游离甲状腺素(FT4)升高的66岁男性患者的临床诊治经过。患者甲状腺功能检测结果显示，FT4明显升高，而促甲状腺激素(TSH)未受抑制。在不同检测平台复测发现FT4未出现一致性升高，这提示FT4的检测可能受到了干扰。放射免疫沉淀试验证明患者体内存在抗甲状腺素自身抗体(T4Ab)，且为IgM亚型。复习相关文献，侧重阐述甲状腺激素自身抗体干扰的识别和鉴别诊断。
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甲状腺激素自身抗体是一种抗甲状腺素(thyroxine, T4)或三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine, T3)的内源性抗体，目前已经发现多种亚型，主要以IgG和IgM亚型为主。甲状腺激素自身抗体并不罕见，在各种甲状腺疾病或非甲状腺疾病患者，甚至在健康人体内都可以检测到。少数情况下甲状腺激素自身抗体可以干扰甲状腺功能检测。本研究报道1例新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)感染后产生的抗甲状腺素抗体(T4Ab)干扰导致游离甲状腺素(free thyroxine, FT4)假性升高的病例，希望通过此病例的报道提醒广大医生在临床实践中如出现与临床症状不符或看似矛盾的甲状腺功能检测结果时，要考虑到甲状腺激素自身抗体干扰，以免误诊误治。
患者男性，66岁，2023年2月COVID-19感染后出现心悸、乏力症状。2023年3月曾于当地医院就诊，怀疑甲状腺功能亢进症，进行甲状腺功能检测(检测平台为ADVIA Centaur XP，西门子，美国)：促甲状腺激素(TSH)3.028 mIU/L(参考范围0.35～5.5 mIU/L，下同)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)5.39 pmol/L(2.7～6.5 pmol/L)、FT4 31.24 pmol/L(11.5～22.7 pmol/L)、总三碘甲状腺原氨酸(TT3)1.8 nmol/L(0.92～2.79 nmol/L)、总甲状腺素(TT4)135.3 nmol/L(58.1～140.6 nmol/L)。患者否认多食善饥、手抖、多汗等高代谢症状。既往史：血脂异常5年，口服阿托伐他汀治疗；高尿酸血症病史3年，口服苯溴马隆片治疗。
体格检查：身高175 cm，体重68 kg，体重指数22.20 kg/m2。血压130/85 mmHg(1 mmHg＝0.13 kPa)，心率85次/min。甲状腺无肿大，质韧，无压痛，未触及甲状腺结节，无震颤及血管杂音。针对患者血清FT4升高，FT3、TSH正常，在其他平台进行了甲状腺功能复测(表1)。甲状腺功能及相关实验室检测结果：甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)193.79 IU/mL(0～5.61 IU/mL)、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)338.03 IU/mL(0～4.11 IU/mL)、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)0.8 IU/L(0～1.75 IU/L)、反三碘甲状腺原氨酸(rT3)1.242 ng/mL(0.511～0.899 ng/mL)、性激素结合球蛋白(SHBG)56.8 nmol/L(10～57 nmol/L)、甲状腺激素结合球蛋白(TBG)25.2 μg/mL(14～31 μg/mL)。甲状腺彩超：甲状腺多发结节伴囊性变[中国版甲状腺结节分类标准(C-TIRADS)3类]。24 h动态心电图显示室性早搏。
患者在不同分析平台的甲状腺功能检测结果
患者在不同分析平台的甲状腺功能检测结果
| 分析平台 | TSH(mIU/L) | FT3(pmol/L) | FT4(pmol/L) | TT3(nmol/L) | TT4(nmol/L) |
|---|---|---|---|---|---|
| ADVIA Centaur XP(一步法) | |||||
| 检测结果 | 2.964 0 | 4.43 | 30.83↑ | 1.31 | 134.20 |
| 参考范围 | 0.35～5.50 | 2.70～6.50 | 11.5～22.7 | 0.92～2.79 | 58.10～140.60 |
| Architect(两步法) | |||||
| 检测结果 | 2.609 5 | 4.24 | 13.33 | 1.23 | 118.94 |
| 参考范围 | 0.35～4.94 | 2.43～6.01 | 9.01～19.05 | 0.54～2.96 | 62.68～150.84 |
| UniCel Dxi 800 Access(两步法) | |||||
| 检测结果 | — | — | 13.42 | — | — |
| 参考范围 | — | — | 7.98～16.02 | — | — |
注：TSH：促甲状腺激素；FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4：游离甲状腺素；TT3：总三碘甲状腺原氨酸；TT4：总甲状腺素；ADVIA Centaur XP(西门子，美国); Architect(雅培，美国); UniCel Dxi 800 Access(贝克曼库尔特，美国); ↑：表示高于正常范围上限；－：未检测
由于患者FT4检测结果在不同平台存在差异，因此不能除外检测干扰导致测定结果的假性升高。故进行聚乙二醇(PEG-6000)沉淀试验，取250 μL患者血清与等体积的25%PEG-6000或等体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS)充分混匀，离心后取上清液进行甲状腺功能检测，同时计算回收率。公式如下：(25%PEG-6000沉淀后数值)/(PBS 1∶2稀释后数值)×100%。25%PEG-6000沉淀后患者FT4从30.83 pmol/L降低到12.17 pmol/L，回收率为53.52%。患者回收率明显低于正常对照人群和Graves病患者，说明患者FT4的检测受到了内源性抗体的干扰(表2)。
聚乙二醇沉淀试验
聚乙二醇沉淀试验
| 对象 | FT3(pmol/L) | FT4(pmol/L) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 沉淀前 | 1∶2稀释 | 沉淀后 | 回收率 | 沉淀前 | 1∶2稀释 | 沉淀后 | 回收率 | |
| 本例患者 | 4.43 | 4.25 | 3.66 | 86.12% | 30.83 | 22.74 | 12.17 | 53.52% |
| 正常人1 | 4.62 | 4.44 | 3.96 | 89.19% | 12.93 | 11.17 | 10.09 | 90.33% |
| 正常人2 | 5.56 | 4.97 | 4.22 | 84.91% | 13.51 | 11.86 | 10.80 | 91.06% |
| Graves病患者1 | 17.08 | 14.66 | 11.45 | 78.10% | 53.13 | 43.81 | 35.13 | 80.19% |
| Graves病患者2 | 18.19 | 14.75 | 11.22 | 76.07% | 52.23 | 41.64 | 35.38 | 84.97% |
| 参考范围 | 2.7～6.5 | 11.5～22.7 | ||||||
注：FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4：游离甲状腺素；检测均在ADVIA Centaur XP(西门子，美国)平台上进行
为了检测干扰源是否为异嗜性抗体(HA)，用异嗜性抗体阻断试管(HBT；购于Scantibodies公司，美国)处理患者血清，取500 μL患者血清加入HBT底部，盖好盖子轻轻翻转振荡5次，使样品与试剂充分混合，室温(18℃～28℃)培养1 h。在ADVIA Centaur XP平台检测FT4，处理后FT4无明显变化(表3)，说明并不是HA干扰了患者FT4的检测。
异嗜性抗体阻断试管处理前后患者甲状腺功能检测结果
异嗜性抗体阻断试管处理前后患者甲状腺功能检测结果
| 组别 | TSH(mIU/L) | FT3(pmol/L) | FT4(pmol/L) | TT3(nmol/L) | TT4(nmol/L) |
|---|---|---|---|---|---|
| 处理前 | 2.782 | 4.15 | 28.64↑ | 1.25 | 132.8 |
| 处理后 | 2.908 | 4.26 | 29.05↑ | 1.22 | 131.6 |
| 参考范围 | 0.35～5.5 | 2.7～6.5 | 11.5～22.7 | 0.92～2.79 | 58.1～140.6 |
注：TSH：促甲状腺激素；FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4：游离甲状腺素；TT3：总三碘甲状腺原氨酸；TT4：总甲状腺素；检测均在ADVIA Centaur XP(西门子，美国)平台上进行；↑：表示高于正常范围上限
为明确内源性抗体干扰是否为T4Ab，进行放射免疫沉淀试验，将患者50 μL血清与100 μL 125I-T3或125I-T4(购于天津协和医药科技集团有限公司，中国)溶液一起孵育，然后用25% PEG-6000沉淀，沉淀物中的放射性计数用B表示，100 μL 125I-T3或125I-T4溶液的总放射性计数用T表示，用B/T表示患者体内甲状腺激素自身抗体的滴度。结果显示，患者T4 B/T为15.17%，而30名甲状腺功能正常人为3.24%±0.95%，7例Graves病患者为6.12%±1.57%。为了明确患者T4Ab的亚型，用山羊抗人IgG或IgM(抗体购于北京百奥莱博科技有限公司，中国)代替25%PEG-6000沉淀，患者T4-IgG为3.41%，与2名甲状腺功能正常人无差异，而T4-IgM为20.31%，明显升高，因此患者的T4Ab为IgM亚型(表4)。
甲状腺激素自身抗体的亚型
甲状腺激素自身抗体的亚型
| 对象 | T4-IgM | T4-IgG | T3-IgM | T3-IgG |
|---|---|---|---|---|
| 患者 | 20.31% | 3.41% | 7.00% | 10.28% |
| 正常人1 | 5.68% | 4.78% | 9.88% | 10.06% |
| 正常人2 | 2.68% | 4.27% | 6.42% | 11.39% |
注：T4：甲状腺素；T3：三碘甲状腺原氨酸
生理情况下，分泌到血液中T4和T3与TBG、甲状腺激素运载蛋白(TTR)和人血白蛋白(HSA)结合并被输送到靶组织发挥作用。二十世纪五六十年代，人们认为T4主要的运载蛋白是α球蛋白和HSA，但在1956年，Robbins等[1]在1例131I治疗甲状腺乳头状癌伴有肺转移的女性患者体内发现大量与T4异常结合的γ球蛋白，后来证明这种γ球蛋白是甲状腺激素自身抗体。国外研究报道，甲状腺激素自身抗体的患病率在健康人中约0%～1.8%，而在自身免疫性甲状腺疾病中约为0%～25%[2,3]。国内一项单中心研究显示，在桥本甲状腺炎中甲状腺激素自身抗体的患病率为22.8%，Graves病中为45.6%，而非甲状腺的自身免疫性疾病中甲状腺激素自身抗体的患病率为61.5%，当合并TPOAb或TgAb阳性时，甲状腺激素自身抗体患病率高达71.3%[4]。98例甲状腺激素自身抗体阳性患者中，有9例(9.18%)受到了检测干扰(1例FT3和8例FT4假性升高)[4]。不同研究中，甲状腺激素自身抗体患病率和干扰甲状腺功能检测发生率的差异与样本的选择、诊断甲状腺激素自身抗体的方法、甲状腺功能检测自动化分析平台以及甲状腺激素自身抗体的亲和力等因素有关。虽然甲状腺激素自身抗体的患病率很高，但其干扰甲状腺功能检测的发生率却不高。
甲状腺激素自身抗体是如何产生的至今仍不清楚。甲状腺激素是半抗原，很少引起自身免疫反应，有学者推测当甲状腺滤泡细胞破坏，使甲状腺激素与甲状腺球蛋白(Tg)同时释放入血，就可能会产生甲状腺激素自身抗体[5]。也有研究显示，病毒感染也可能会导致甲状腺激素自身抗体的产生，Shimon等[6]报道了1例16岁女性在急性EB病毒感染后出现了严重的甲状腺功能减退症状，甲状腺功能检测结果显示TSH 198 mU/L(0.4～4 mU/L)、FT4 2.5 pmol/L(10～25 pmol/L)、FT3 0.77 pmol/L(3.3～6.3 pmol/L)、TT3>19.5 nmol/L(1.3～2.7 nmol/L)。明显升高的TT3与临床症状和其他甲状腺功能检测指标矛盾，放射免疫沉淀试验显示，患者的T3结合力明显升高为86%(正常对照为5.5%～8.5%)。Zouwail等[7]也报道了1例19岁的男性患者在病毒感染后出现了长期的疲倦症状，患者FT3和FT4明显升高，而TSH正常，最后证实是甲状腺激素自身抗体干扰造成FT3和FT4的假性升高。研究显示，COVID-19感染后会引起Graves病和亚急性甲状腺炎，这些疾病都与甲状腺激素自身抗体的产生密切相关[8,9,10]。本例患者也是COVID-19感染后1个月出现FT4升高，且T4Ab为IgM型，提示T4Ab可能与其新近感染COVID-19有关。
免疫测定法是目前临床中广泛采用的测定血清甲状腺激素的方法，其优点是自动化检测，速度快、价格低，但缺点是容易受到内源性甲状腺激素自身抗体的干扰。根据孵育过程中清洗的次数可分为一步法和两步法[11]。在一步法中，患者血清和示踪剂(标记的激素或激素类似物)同时加入反应体系，竞争捕获抗体上有限的结合位点，之后进行清洗、显色。如果血清中存在甲状腺激素自身抗体，会与示踪剂结合，这样就导致示踪剂与捕获抗体的结合减少，检测信号降低，从而导致待测激素的假性升高。两步法中患者血清首先与捕获抗体孵育，然后进行第1次清洗，之后再加入示踪剂、清洗、显色，这就减少了血清甲状腺激素自身抗体与示踪剂结合的机会，因此两步法受到甲状腺激素自身抗体干扰的可能性小，但是如果甲状腺激素自身抗体的滴度过高或亲和力过强，两步法仍然会受到干扰[12]。本研究报道的病例就是在一步法中发现FT4升高，而两步法中FT4正常。
识别甲状腺激素自身抗体干扰的主要目的是避免误诊误治。临床上遇到FT4和(或)FT3升高，而TSH未被抑制时，要注意鉴别以下情况。一类是甲状腺罕见疾病，例如β型甲状腺激素抵抗(RTHβ)、家族性白蛋白异常性高甲状腺激素血症(FDH)和TSH瘤[7,12,13,14]。研究报道，因甲状腺激素自身抗体干扰被误诊为TSH瘤而错误的使用奥曲肽治疗，或被误诊为甲状腺功能亢进而应用甲巯咪唑治疗[13,14,15,16,17]。另一类是甲状腺激素的检测干扰，例如过量的生物素、抗链霉亲和素抗体、抗钌抗体或甲状腺激素自身抗体。
本研究报道的患者是1例老年男性患者，因心悸、乏力进行甲状腺功能检测，结果为FT4升高，而FT3和TSH正常，经过2个其他检测平台复查，FT4均正常。不同检测平台甲状腺功能检测结果不一致往往提示检测干扰。因此，甲状腺罕见疾病RTHβ、FDH和TSH瘤基本被排除，考虑甲状腺激素检测干扰的可能性大。
首先，需要确定干扰源。用生物素-链霉亲和素作为固定系统的检测平台，过量的生物素或抗链霉亲和素抗体的干扰会导致FT4和(或)FT3假性升高[18,19]。ADVIA Centaur XP(一步法)和UniCel Dxi 800 Access(两步法)平台FT4的检测都采用生物素作为固定系统中的一部分，但在这2个平台上FT4并没有一致性的升高(UniCel Dxi 800 Access FT4正常)。Architect(两步法)平台FT4检测采用的是非生物素-链霉亲和素固定系统，FT4检测结果正常，结合患者没有服用生物素的既往史，排除了过量生物素或抗链霉亲和素抗体干扰的可能。用钌作为检测信号标记的平台，当存在抗钌抗体时可能会导致FT4和(或)FT3假性升高，少数情况下会导致FT4和(或)FT3假性降低[20,21]。但是以上3个甲状腺功能检测平台在FT4测中均没有使用钌作为标记，因此推测也不可能是抗钌抗体的干扰。HA是在免疫反应早期形成的多特异性、低效价的抗体。HA与捕获抗体和(或)检测抗体结合后，会干扰甲状腺功能检测。FT4检测过程中，HA与捕获抗体结合，使示踪剂与捕获抗体结合减少，导致检测结果假性升高。制造商在检测缓冲液中添加了与捕获抗体同物种的免疫球蛋白(即HA封闭剂)，但这不能完全消除HA干扰甲状腺功能检测的可能性。为了进一步确认，本研究进行了HBT处理，处理前后FT4没有明显变化，因此FT4检测的干扰源不是HA。如前所述，甲状腺激素自身抗体是一种内源性抗体，其可能通过与示踪剂结合干扰甲状腺功能检测，因此甲状腺激素自身抗体的干扰和是否与示踪剂接触(即清洗次数)密切相关。甲状腺功能检测结果在一步法与两步法平台的差异是鉴别甲状腺激素自身抗体干扰的重要线索。本例患者FT4水平在一步法平台(ADVIA Centaur XP)升高，而在两步法平台(UniCel Dxi 800 Access和Architect)均正常，这表明干扰很可能是甲状腺激素自身抗体。为了验证是否为甲状腺激素自身抗体干扰，首先进行了聚乙二醇沉淀试验，PEG-6000可以沉降血清中的免疫球蛋白(如甲状腺激素自身抗体、HA等)，在去除干扰抗体后，重新测定血清中甲状腺激素水平，通过回收率计算，就能初步判定有无干扰。如表2所示，25%PEG-6000沉淀后患者FT4从30.83 pmol/L降低至12.17 pmol/L，回收率显著降低，说明ADVIA Centaur XP(一步法)FT4的检测很有可能受到甲状腺激素自身抗体的干扰。之后应用放射免疫沉淀试验测定沉淀物中的放射性计数，进一步验证了25%PEG-6000沉淀物中的干扰抗体为T4Ab。
另一个值得思考的问题是为何T4Ab未干扰TT4的检测。甲状腺激素自身抗体单独干扰游离或总甲状腺激素的原因可能与检测平台的设计等因素有关。根据ADVIA Centaur XP的检测说明书，FT4和TT4的检测设计有很大不同。首先，捕获抗体的差异，FT4使用生物素标记的兔抗T4多克隆抗体作为捕获抗体，而TT4的捕获抗体是吖啶酯标记的鼠抗T4单克隆抗体。捕获抗体标记和种属的差异会使两种检测指标受到不同类型的干扰，比如FT4的检测会受到过量生物素的干扰，而TT4不会，但是TT4的检测会受到人抗鼠抗体的干扰，而FT4受干扰的可能性很小。其次，示踪剂与固定系统之间的关系不同，FT4检测设计中示踪剂与固定系统通过捕获抗体间接结合，而TT4检测设计中示踪剂预先与顺磁性颗粒共价结合，推测这种结合可能会占用或遮蔽甲状腺激素自身抗体与示踪剂的结合位点，因此TT4的检测没有受到干扰。
甲状腺激素自身抗体可以导致甲状腺激素检测结果的假性升高，但是对人体并无伤害，因此无须治疗，目前也没有针对甲状腺激素自身抗体的特异性治疗方法，主要的应对措施是治疗原发病，同时积极检测甲状腺激素自身抗体的变化，避免误诊误治。
综上，本研究报道了1例COVID-19感染后FT4假性升高的男性患者的临床诊治经过，希望通过此病例的报道提醒广大医生在临床实践中如发现患者甲状腺激素水平升高，而缺乏甲状腺疾病的临床表现时，要考虑到甲状腺激素自身抗体的干扰，避免误诊误治。目前，国内尚缺乏COVID-19感染后出现甲状腺激素自身抗体干扰甲状腺功能检测的报道，希望通过此病例给广大临床医生一些启示。
所有作者均声明不存在利益冲突
