研究蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)的磷酸化及其下游的C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的表达在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)中的作用和机制。
60只新生7日龄SD大鼠分为假手术组和HIBD组，每组各30只，每组又按照手术0 h，6 h和24 h分为3个亚组，每组10只。采用流式细胞仪检测脑细胞凋亡情况，并用Western blot方法测定脑组织中磷酸化的PERK及CHOP表达水平。
(1) HIBD 6 h出现典型的凋亡细胞峰，细胞凋亡率为(2.17±0.19)%。HIBD 24 h凋亡峰更为明显，细胞凋亡率达到(13.42±0.83)%，与假手术组(0.57±0.06)%相比，差异有统计学意义(P<0.01)。(2)假手术组与HIBD 0 h大鼠脑组织中磷酸化的PERK和CHOP表达水平较低，在HIBD 6 h后二者表达开始上升，24 h上升更加明显，而假手术组各个时间点二者表达差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，HIBD组各时间点二者的表达均明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)。(3)缺氧缺血后各时间点磷酸化的PERK的表达和CHOP的表达呈正相关(r＝0.997，P<0.05)。
脑缺氧缺血后，随着凋亡的出现，磷酸化的PERK和CHOP表达水平升高，提示PERK-CHOP通路的活化可能参与了新生大鼠HIBD神经细胞凋亡的发生。
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缺氧缺血性脑损伤( hypoxic-ischemic brain damage，HIBD )是围生期窒息或缺氧缺血性应激所引起的部分或者完全脑部病变，可造成新生儿早期死亡或存活者智能发育障碍、脑性瘫痪和癫痫等中枢神经系统损害[1,2,3]。在1岁以下的脑瘫患儿中，由围生期窒息引起的占25%～50%。本病发病机制比较复杂，细胞坏死和凋亡是HIBD时神经元死亡的两种主要形式，其中凋亡主要发生在急性期过后以及缺血半影区，是HIBD后迟发性细胞损伤的中心环节[4,5]。
内质网作为真核细胞中蛋白质合成修饰以及钙离子存储的主要场所，对刺激十分敏感，缺氧缺血、氧化应激、葡萄糖/营养物质匮乏、ATP耗竭、大量自由基的产生以及钙离子稳态破坏等均可引起内质网功能障碍，触发内质网应激(endoplasmic reticulum stress)，启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)[6,7,8]。内质网应激及其诱导的细胞凋亡与许多疾病的发生发展有着密切的联系，包括神经退行性疾病、糖尿病、缺血-再灌注及一些化学中毒引起的病理损伤[9]。蛋白激酶R样内质网激酶( protein kinase R-like ER kinase，PERK)是内质网应激中起主导作用的反应感受蛋白之一。磷酸化PERK能够上调下游C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)基因的表达，活化细胞凋亡途径，参与细胞的应激反应过程。目前内质网应激在新生大鼠HIBD模型中的研究国内外文献鲜有报道。因此，本实验旨在研究PERK的磷酸化及其下游的CHOP蛋白在HIBD新生大鼠中是否介导缺氧缺血性应激引起的神经元凋亡导致的脑损伤。
7日龄新生清洁级SD大鼠60只，雌雄不限，出生体重12～16 g，购自中国医科大学实验动物中心。大鼠分为假手术组和HIBD组各30只，每组又按照手术0 h、6 h和24 h分为3组，每组10只。
参照Rice等[10]的方法，将SD大鼠经乙醚麻醉后，颈部正中切口，分离并双道结扎左侧颈总动脉，缝合皮肤，术后休息2 h，而后将动物置于含有8%氧气的密闭容器中2 h，即制备HIBD动物模型。假手术组动物只分离左侧颈总动脉，不结扎，亦不作低氧处理。各组动物于相应时间点断头处死，肉眼观察每只新生大鼠脑组织的大体形态变化。同时分离结扎侧脑皮质，存于液氮中。
取左侧大脑组织，剪碎后加入冰PBS 10 ml，反复吹打，取上清液1 ml，以1 000 g/min的速度离心8 min，制备单细胞悬液，调细胞浓度为2×106/ml。取1 ml细胞悬液加RNAse( 1 mg/ml)，37 ℃水浴30 min，PBS洗2次，再次离心，沉淀加入0.4 ml PBS，加入400 UPI(50 μg/ml)。低温避光放置，3 h内进行流式细胞仪(FACScan流式细胞仪美国BD公司)检测。根据PI染色的凋亡细胞数量占总体细胞数量的百分比，计算出凋亡率。
提取脑组织蛋白质，每份100 mg，用RIPA裂解液裂解蛋白，超声，离心，轻吸上清液为组织细胞总蛋白，BCA法蛋白定量检测。SDS-PAGE凝胶电泳后转膜1 h。5%脱脂牛奶封闭1 h后，用1∶1 000稀释的一抗4 ℃孵育过夜。洗膜后，用1∶5 000稀释的二抗孵育。ECL显色图像采集和统计学分析。
所有数据结果以均值±标准差(
±s)表示，HIBD组和假手术组间采用两独立样本t检验，不同时间点用单因素方差分析(ANOVA)，两者相关性采用Pearson相关分析。应用SPSS 17.0处理数据，P<0.05为差异有统计学意义。
HIBD组在G1峰之前均出现典型的凋亡细胞峰，而假手术组并未观察到明显的凋亡峰。假手术组细胞凋亡率为(0.57±0.06)%，HIBD组6 h为(2.17±0.19)%，HIBD组24 h为(13.42±0.83)%。HIBD组明显高于假手术组，差异有统计学意义( P< 0.01)。
假手术组与HIBD组0 h大鼠脑组织中磷酸化的PERK和CHOP蛋白有少量表达，而在HIBD 6 h其表达均开始上升，24 h升高更加明显，具有时间依赖性，而假手术组各个时间点二者表达无明显差异，见图1、图2。且HIBD后各时间点，磷酸化的PERK和CHOP蛋白表达水平均较假手术组升高，差异有统计学意义( P<0.01 )，见表1，表2。
PERK：蛋白激酶R样内质网激酶；HIBD：缺氧缺血性脑损伤。
CHOP：C/EBP同源蛋白；HIBD：缺氧缺血性脑损伤。
两组不同时间点大鼠脑组织中磷酸化PERK的表达变化(
±s)
两组不同时间点大鼠脑组织中磷酸化PERK的表达变化(±s)
| 分组 | 鼠数(只) | 0 h | 6 h | 24 h | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 假手术组 | 30 | 3.11±0.46 | 2.61±0.31 | 3.05±0.52 | 1.18 | >0.05 |
| HIBD组 | 30 | 2.88±0.33 | 6.84±0.51a | 13.07±0.87ab | 211.84 | <0.01 |
| t值 | －0.69 | 12.30 | 17.21 | |||
| P值 | >0.05 | <0.01 | <0.01 |
注：与HIBD组0 h比较，aP<0.01；与HIBD组6 h比较，bP<0.01；PERK：蛋白激酶R样内质网激酶。
两组不同时间点大鼠脑组织中CHOP的表达变化(
±s)
两组不同时间点大鼠脑组织中CHOP的表达变化(±s)
| 分组 | 鼠数(只) | 0 h | 6 h | 24 h | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 假手术组 | 30 | 1.39±0.41 | 1.86±0.29 | 1.47±0.36 | 1.51 | >0.05 |
| HIBD组 | 30 | 1.60±0.35 | 10.49±0.79a | 20.32±1.16ab | 421.05 | <0.01 |
| t值 | 0.69 | 17.79 | 28.40 | |||
| P值 | >0.05 | <0.01 | <0.01 |
注：与HIBD组0 h比较，aP<0.01；与HIBD组6 h比较，bP<0.01；CHOP：C/EBP同源蛋白。
HIBD后各时间点，磷酸化的PERK和CHOP的蛋白表达量呈正相关( r＝0.997，P<0.05)。
新生儿HIBD是围生期最常见的脑损伤原因，也是引起儿童脑病、精神损害、惊厥和持续性运动障碍的主要原因。HIBD是一个多因素、多机制的级联损伤过程，这个级联过程包括许多环节，如能量障碍、兴奋性氨基酸释放、炎性反应、自由基生成、细胞内钙失稳态、凋亡基因激活等[11]。这些环节互为因果并相互联系，最终导致细胞死亡。HIBD时脑细胞死亡有两种形式，即细胞坏死和细胞凋亡。在缺氧缺血导致的损伤中，凋亡占很大的比例，且持续时间较长，是加重脑损伤的一个重要因素[12]。近年来，与凋亡有关的信号通路在缺氧缺血性脑损伤中的作用成为研究热点[13]。我们的前期工作中，以新生大鼠为研究对象建立了HIBD模型[14]，采用流式细胞仪检测新生大鼠HIBD模型中脑细胞凋亡情况，假手术组未见明显的凋亡峰，而HIBD 6 h后脑细胞开始出现典型的凋亡峰，缺氧缺血24 h后细胞凋亡则更为明显，与假手术组比较具有显著性差异。随着HIBD的发展，脑细胞的凋亡现象越来越明显，提示凋亡是导致大鼠脑组织损伤的重要原因之一。
内质网作为真核细胞中蛋白质合成修饰的主要场所，对缺氧缺血等刺激十分敏感，已有研究报道，肌醇需求因子1(inositol requiring enzyme 1)作为内质网应激关键分子之一，在HIBD新生大鼠大脑皮层中被激活[15]。PERK是内质网内的另一个介导内质网应激反应的重要感受分子，正常状态下与葡萄糖调节蛋白78结合成无活性的复合物，没有核酸内切酶活性；内质网应激时，由于大量葡萄糖调节蛋白78被用于结合未折叠蛋白或错误折叠蛋白，使得PERK游离、聚合、磷酸化，从而使PERK自身激活并启动PERK介导的UPR通路[16]。PERK通路活化所致的蛋白质合成抑制在短时间内与细胞的自我保护、促进细胞存活有关，长时间的蛋白质合成抑制则可通过一些致凋亡基因如CHOP、Caspase的表达最终引起细胞凋亡[17,18]。已有研究发现，视网膜神经细胞的缺氧缺血可激发PERK引起的内质网应激[19]。但PERK在HIBD新生大鼠脑神经细胞中的作用尚无报道。
那么HIBD是否会磷酸化PERK进而激活PERK-CHOP通路，并且导致凋亡发生呢？在本实验中，首先我们采用流式细胞仪检测脑细胞凋亡情况，HIBD 6 h出现典型的凋亡细胞峰，24 h凋亡更加明显，说明HIBD导致凋亡的发生。进一步利用Western blot方法观察到，HIBD新生大鼠与假手术组相比，PERK总蛋白的表达情况无差异，而磷酸化的PERK蛋白在假手术组中表达较低，HIBD后6 h即可检测到磷酸化的PERK蛋白表达开始升高，24 h升高更为显著，具有时间依赖性。并且HIBD各时间点PERK蛋白磷酸化水平均较假手术组表达明显升高。这说明HIBD可以磷酸化PERK蛋白，并且磷酸化程度具有时间依赖性。那么磷酸化的PERK能否促进其内质网信号通路中下游CHOP蛋白的表达呢？我们同样通过Western blot方法检测了HIBD前后CHOP蛋白的表达。假手术组中CHOP的表达与磷酸化的PERK同样较低，而在HIBD后6 h CHOP表达开始上升，24 h左右升高更明显；且HIBD各时间点CHOP蛋白表达水平均较假手术组表达明显升高。另外，HIBD后各时间点磷酸化的PERK和CHOP的蛋白表达量呈正相关，说明PERK磷酸化以后促进了其下游的凋亡蛋白CHOP的表达，从而引起了脑细胞的凋亡。结果提示，HIBD可能诱发了内质网应激反应，启动了PERK磷酸化介导的UPR通路，PERK-CHOP通路的激活加速了脑细胞的凋亡过程，为新生儿HIBD的防治提供了新思路。
