观察肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)在急性缺血缺氧再灌注肾损伤(acute ischemia reperfusion kidney injury，AIKI)大鼠肾组织中的表达及分布规律，探讨其在诊断急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)中的价值。
采用清洁级SD大鼠128只，随机分为对照组和模型组，模型组按国际标准建立大鼠AIKI模型，分别于2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周处死(n＝8)，取肾组织，常规HE染色，参照Sayhan等标准对肾小管间质损伤进行半定量评分；免疫组织化学、Western blot法检测KIM-1蛋白的表达及分布；生化法测定血清肌酐(serum creatinine，Scr)水平。
(1)大鼠缺血再灌注后2 h即出现明显肾小管间质损伤，随着再灌注时间延长损伤加重，48 h达高峰后逐渐减轻，但仍高于对照组(P<0.01)；(2)Western blot和免疫组织化学检测发现，缺血再灌注后2 h肾组织KIM-1的表达明显升高，KIM-1表达水平与肾小管间质损伤评分呈显著正相关(r＝0.887，P＝0.003)；(3)大鼠缺血再灌注后2 h Scr明显升高，48 h达到最高值后降至正常，其升高与肾小管间质损伤评分无相关性(r＝0.280，P＝0.502)。
AIKI模型中大鼠肾组织KIM-1蛋白表达水平显著增加，其表达水平与肾小管间质损伤评分呈正相关，与Scr相比，KIM-1可能为更准确地反映肾损伤情况的指标。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)为临床常见危重症，指多种原因引起的肾小球滤过率突然下降，临床表现为氮质血症、水电解质和酸碱平衡紊乱以及全身各系统症状[1]。虽然近年来AKI的诊疗水平有了长足的进展，但其病死率仍然高达5%～10%，伴肾外器官衰竭者可达50%～70%[2]。目前认为AKI病死率居高不下的可能原因之一与缺乏可靠的早期损伤标志物有关。因此，近年来AKI早期标志物一直是业界研究的热点，现已发现一系列AKI早期标志物[3]，其中肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)被认为是最有价值的AKI早期诊断生物学标志物之一[4,5]。KIM-1是一种新型Ⅰ型跨膜糖蛋白，在正常肾组织几乎不表达，但在缺血、肾毒性所致的AKI中大量表达于近端肾小管上皮细胞，其胞外段可脱落并在尿液中检测出来。尽管KIM-1作为AKI早期标志物受到了越来越多的关注，但仍无充分的证据显示其在诊断AKI方面优于血肌酐(serum creatinine，Scr)，AKI的诊断仍主要依赖Scr，KIM-1还未在临床广泛应用。本研究旨在探讨急性缺血缺氧再灌注肾损伤(acute ischemia reperfusion kidney injury，AIKI)模型大鼠肾组织KIM-1的表达、分布规律及其与肾小管间质损伤之间的关系，并在反映肾小管间质损伤准确性方面与Scr进行比较，为KIM-1作为AKI生物标志物的临床应用提供理论依据。
清洁级SD大鼠128只，6～8周龄，雌雄各半，体重(200±20) g，购买自中科院上海实验动物中心，饲养于上海交通大学医学院动物科学部。
羊抗大鼠KIM-1抗体(美国R&D公司)；辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(美国Santa Cruz公司)；兔抗鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体(英国Abcam公司)；全蛋白提取试剂(上海碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白浓度监测试剂盒(美国Thermo fisher公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；预染蛋白marker(美国Thermo fisher公司)；ECL化学发光试剂盒(美国Thermo fisher公司)。
全自动生化分析仪(HITACHI)；高速冷冻离心机(Eppendorf)；显微镜(Leica)；凝胶成像分析系统(Carestream Health)。
采用国际公认的双侧肾蒂夹闭法建立AIKI模型：大鼠术前禁食12 h，腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，腹部正中切口进入腹腔，小心分离双侧肾蒂，微型动脉夹夹闭双侧肾蒂45 min(肾脏颜色由鲜红色变为暗红色即提示双侧肾脏缺血，开始计时)，移去微型动脉夹，恢复动脉血供(肾脏由暗红色变成鲜红色，表明肾脏再灌注完成，开始记录再灌注时间)。逐层关腹，将大鼠放回鼠笼予正常饮食和饮水。对照组除了不夹闭双侧肾蒂外，其余操作和模型组相同。
128只大鼠随机分为对照组(CON组)和模型组(AIKI组)。AIKI组64只，全部建立AIKI模型，并分别在手术后2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周各处死8只，对照组64只，分别于上述各时间点处死8只。
大鼠麻醉后，开腹小心分离腹主动脉，注射器取血1 ml。取血后，用生理盐水经腹主动脉反复盥洗肾脏至颜色苍白，取两侧肾脏，去除肾包膜，于冠状面剖开肾脏，一部分肾脏置于10%多聚甲醛溶液中固定，剩余肾脏组织置于预先标记的冻存管中，并迅速置于液氮罐保存。
多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，经HE染色后光镜观察肾组织形态学改变。肾小管间质损伤的特征参照Sayhan等[6]标准，在光镜下双盲观察，每张切片于400倍显微镜下随机选取10个肾小管间质视野，观察肾小管肿胀、变性、坏死、萎缩，刷状缘丢失，间质水肿，对炎症细胞浸润的情况进行评分。评价指标包括：(1)肾小管萎缩；(2)肾小管变性、坏死；(3)间质炎症细胞浸润；(4)间质纤维化，根据肾小管-间质病变的范围，按无、轻度(<25%)、中度(25%～50%)、重度(>50%)、极重度(>75%)分别记为0、1、2、3、4分。取均值作为该标本的统计数值，分数越高表示损伤程度越严重。
肾组织切片经脱蜡，水化，去除内源性过氧化氢酶，微波抗原修复，山羊血清封闭，加KIM-1抗体(KIM-1一抗浓度为1∶1 000)，置于37 ℃恒温箱1 h，孵育二抗，DAB显色0.5～2 min，显微镜下控制着色，脱水，中树脂封片。应用Image Pro Plus图像分析软件对免疫组织化学结果进行半定量分析，每张切片随机取10个不重叠400×高倍镜视野，以胞质内深棕色颗粒为阳性信号，计算每个视野下阳性染色的积分光密度值(IOD)，最后取IOD均值。
肾组织从冻存管中取出称重，切取100 mg左右肾脏组织，加入预冷的含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，组织低温低速匀浆，离心，BCA法测定肾组织蛋白浓度。蛋白煮沸变性，SDS-PAGE分离蛋白，湿法将蛋白质转移到PVDF膜上。转膜结束后将PVDF膜取出置于5%脱脂奶粉封闭液，摇床缓慢封闭2 h。加入KIM-1或GAPDH一抗，工作浓度分别为1∶1 000和1∶10 000，4 ℃孵育过夜；加入对应二抗，室温孵育1 h，用ECL化学发光试剂显影。显影后，以GAPDH作为内参，采用Image J软件检测各组条带的灰度，以KIM-1与GAPDH的灰度比值为分析对象。
采用日本HITACHI公司7180全自动生化分析仪检测大鼠Scr水平。
采用SAS 6.12统计软件包进行统计，所有计量资料采用均数±标准差(
±s)表示，两样本均数间比较采用t检验，采用Pearson线性相关分析对两组资料进行相关性检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
AIKI组中约有20%的大鼠术后出现了死亡，CON组假手术后无死亡。与CON组相比，AIKI组再灌注后2 h、6 h、24 h、48 h、72 h大鼠Scr均明显升高(P值均<0.05)，1周、2周、4周时AIKI组Scr水平下降，与CON组相比差异无统计学意义(图1)。HE染色见AIKI组大鼠肾小管上皮细胞扁平、空泡变性、坏死、脱落，肾小管扩张，近曲小管刷状缘脱落，红细胞管型、蛋白管型，间质水肿，炎性细胞增生等，随着再灌注时间的延长，上述损伤加重；至再灌注1周后上述病变较前减少，4周时部分肾小管萎缩，纤维化(图2A)。AIKI组各个时间点肾小管间质损伤评分明显高于CON组(图2B)。
CON：对照组，AIKI：急性缺血缺氧再灌注肾损伤组；与对照组比较，aP<0.01，bP<0.05，n＝8。
CON 2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1 w、2 w、4 w分别代表对照组2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周组，AIKI 2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周分别代表缺血再灌注后2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周组。
CON：对照组，AIKI：急性缺血缺氧再灌注肾损伤组；与对照组比较，aP<0.01，n＝8。
缺血再灌注后KIM-1主要表达于形态相对正常的肾小管，完全萎缩的肾小管、肾小球和肾小管间质细胞中无KIM-1表达；KIM-1染色阳性的区域主要位于髓质区(图3A)。
CON 2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1 w、2 w、4 w分别代表对照组2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周组，AIKI 2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周分别代表缺血再灌注后2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周组。
大鼠正常肾组织KIM-1的表达量甚少，再灌注后2 h已有KIM-1的表达，随着时间的延长，肾组织KIM-1表达逐渐增多，再灌注后48 h KIM-1的表达量达最高值，48 h后肾组织KIM-1的表达有下降的趋势但仍高于对照组(图3B)。
CON：对照组，AIKI：急性缺血缺氧再灌注肾损伤组；与对照组比较，aP<0.05,n＝8。
Western blot检测KIM-1的表达显示，正常大鼠KIM-1表达甚少，缺血再灌注后KIM-1的表达量增多，其变化规律与免疫组织化学一致；CON组、AIKI组KIM-1 Western blot检测结果及其与GAPDH的积分灰度值比值见图4A、图4B。
1、2、3、4、5、6、7、8分别代表缺血再灌注后2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周；9、10、11、12、13、14、15、16、17、18分别代表对照组2 h、6 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周、4周；KIM-1：肾损伤分子-1；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶。
CON：对照组，AIKI：急性缺血缺氧再灌注肾损伤组；与对照组比较，aP<0.05，n＝8；KIM-1：肾损伤分子-1；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶。
为了进一步明确KIM-1在AIKI大鼠肾组织表达水平与AKI的关系，对KIM-1表达水平、Scr与AIKI肾小管损伤评分进行相关性分析，KIM-1表达与肾小管间质损伤程度呈正相关(r＝0.887，P＝0.003)，Scr与肾小管间质损伤程度无相关性(r＝0.280，P＝0.502)，与Scr相比，KIM-1能更准确地反映肾小管间质损伤的程度。
肾小管间质损伤是各种原因引起的AKI的共同特征，其与AKI的严重程度及预后密切相关，其中又以近端肾小管上皮细胞的损伤最为关键[7]。AIKI是临床最常见的AKI病因之一，其主要病理变化表现为急性肾小管坏死、肾小管上皮细胞的损伤。尽管人们对肾损伤的分子生物学机制、病理过程已有所了解，但对于肾小管上皮细胞损伤后修复的机制还不甚清楚，目前的研究成果还未成为临床有效的治疗手段。逆转AKI进展的关键是早期发现与早期干预，但现阶段AKI的诊断仍依赖于Scr、尿素氮等，这些指标易受肾外因素的影响且不能高效灵敏地反映肾损伤，严重影响了AKI的诊疗和预后。目前急需高特异性与灵敏性且无创的AKI早期标志物。
KIM-1是Ichimura等[8]于1998年发现的1种Ⅰ型跨膜蛋白，位于肾小管近曲小管上皮细胞膜上，与肾小管上皮细胞的再生有关。KIM-1在正常肾组织中表达甚微，在肾脏肿瘤、毒物损害、缺血再灌注损伤后大量表达，其表达具有极高的组织特异性[9]。由于其结构特点，肾组织表达的KIM-1胞外段可脱落至尿液进而被检测出来，尿液中脱落的KIM-1胞外段水平与肾组织表达的KIM-1水平一致，因此尿中KIM-1的水平可以反映肾小管损伤的程度，被认为是最有价值的AKI早期诊断生物学标志物之一[10,11,12]。KIM-1作为AKI新兴生物学标志物一直是业界研究的热点，已有研究表明KIM-1主要由受损的近端肾小管上皮细胞表达、释放，肾损伤中KIM-1的表达是把双刃剑：一方面KIM-1参与肾小管间质的炎症与纤维化，加重肾脏的损伤；另一方面表达KIM-1的近端肾小管上皮细胞可以清除凋亡细胞，促进肾小管损伤后再生修复[7]。但目前KIM-1在肾损伤进程中的作用及机制仍未完全清楚，仍有待进一步的研究。
本研究免疫组织化学和Western blot结果均表明，大鼠正常肾组织KIM-1的表达量甚少，缺血缺氧再灌注后2 h已有KIM-1的表达，随着时间的延长，肾组织KIM-1表达逐渐增多，缺血缺氧再灌注后48 h KIM-1的表达量达最高值，48 h后肾组织KIM-1的表达有下降的趋势，但仍高于对照组，KIM-1表达量与肾小管间质损伤程度呈正相关。免疫组织化学观察发现，缺血再灌注后KIM-1主要表达于形态相对正常的肾小管，完全萎缩的肾小管、肾小球和肾小管间质细胞中无KIM-1表达；KIM-1染色阳性的区域主要位于髓质区。我们观察到的KIM-1在肾组织中表达的位置与Ichimura等[8]、Lim等[13]、Chen等[14]报道的一致。Scr是目前诊断AKI的主要指标，通过大鼠AIKI模型我们观察到大鼠缺血缺氧再灌注后2 h Scr升高，至48 h达最高值，随后Scr开始下降，至1周后AIKI组大鼠肾小管间质损伤仍存在，但Scr已达正常水平，Scr的升高与肾小管间质损伤无相关性。因此与Scr相比，KIM-1能更准确地反映肾小管间质损伤的变化情况，为AKI的诊断提供更准确的依据。但检测肾组织KIM-1表达情况为有创性检查，不便于临床检测，已有研究表明尿KIM-1水平与肾组织KIM-1水平呈正相关[15]；尿液收集方便、无创伤且KIM-1在尿液中性质稳定，不受尿液理化特性的影响，检测方法简便，灵敏度高，因此尿KIM-1有望成为评估AKI的理想标志物。本研究由于实验条件所限并未收集大鼠缺血缺氧再灌注后的尿液，尿KIM-1水平与肾小管损伤严重程度之间的关系还有待进一步的研究。除了在AKI动物模型中KIM-1大量表达外，Han等[16,17]报道在急性肾小管坏死的患者尿液中KIM-1也明显升高，KIM-1不仅是AKI的早期标志物，还可以预测发生肾小管坏死的风险，在随后的研究中Han等发现联合检测KIM-1、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶可以在Scr未升高前早前诊断术后患者AKI的发生。Liangos等[18]通过对201例AKI住院患者的观察发现，KIM-1与AKI患者是否需要透析以及住院病死率密切相关。
对于KIM-1的功能目前仍知之甚少，目前认为KIM-1可能具有以下的功能：(1)KIM-1胞外段的Ig结构域与黏附分子相似，可以与肾小管上皮细胞腔侧膜面的整合素结合，防止坏死肾小管上皮细胞及碎片之间相互粘连形成管型阻塞肾小管[19]。(2)KIM-1的大量表达介导了肾小管上皮细胞对凋亡及坏死细胞的吞噬，从而使肾小管上皮细胞作为非专职吞噬细胞在急性肾组织损伤时发挥清道夫作用[20,21]。(3)KIM-1与白细胞单免疫球蛋白样受体5结合影响髓系来源细胞的免疫调节功能[22]。关于KIM-1的功能目前业界仍无统一的认识，仍有待于进一步的研究。本研究观察了在缺血再灌注后肾组织中KIM-1的表达变化情况及其与肾小管间质损伤之间的关系，对于KIM-1在其中的作用仍未明确，还有待进一步的研究。
