探讨潮汕地区2011至2015年重症手足口病病原学变化趋势。
收集2011年5月至2015年8月临床诊断为手足口病收住在我院儿科的患儿咽拭子标本1 410份，应用巢式RT-PCR技术检测肠道病毒，对最后确诊为重症手足口病并且肠道病毒检测阳性病例进行分析。
(1)临床诊断重症手足口病且检测肠道病毒阳性216例(67.29%，216/321)，其中肠道病毒71型(enteroviruses 71，EV71)阳性116例(116/216，53.70%)，柯萨奇A组(coxsackievirus A，CA)16型(CA16)阳性43例(43/216，19.91%)，CA6阳性26例(26/216，12.04%)，CA10阳性19例(19/216，8.80%)，CA4阳性7例(7/216，3.24%)，柯萨奇B组5型阳性2例(2/216，0.93%)，埃可病毒6型阳性1例(1/216，0.46%)，未分型2例(2/216，0.93%)。(2)5例危重症手足口病病例均为EV71阳性。(3)EV71阳性患儿以重症病例为主(51.79%，116/224)，非EV71阳性病例以非重症病例为主(82.08%，458/558)，差异有统计学意义(χ2＝91.68，P<0.001)。(4)重症手足口病比例逐年改变的趋势与EV71构成比改变趋势一致，且两者高度相关(相关系数Rs＝0.9，P＝0.037)。(5)非EV71肠道病毒感染所致的重症手足口病比例逐渐上升。
2011至2015年潮汕地区重症手足口病病原总构成以EV71为主，其他类型的肠道病毒如CA16、CA6、CA10、CA4、柯萨奇B组5型、埃可病毒6型也能引起重症手足口病；在以EV71为优势病原的年份，重症手足口病构成比也相应增加。2013年以后，非EV71肠道病毒感染所致的重症手足口病比例有逐渐上升趋势。
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手足口病是由肠道病毒引起的一种急性传染病，多见于学龄前儿童，尤以3岁以下的年龄组常见。多数患儿临床症状轻微，以发热和手、足、口腔、臀部等部位的皮疹或疱疹为主要临床表现，少数重症患儿可累及神经系统并出现心肺症状，甚至死亡。我国《手足口病诊疗指南(2010年版)》[1]和卫生部手足口病临床专家组[2]对手足口病进行了临床分期，将手足口病有神经系统受累表现者定义为重症病例。目前，很多研究已表明肠道病毒71型(enteroviruses 71，EV71)是引起重症手足口病最主要的病原[3,4,5]，但近年来陆续发现其他类型的肠道病毒也能引起重症感染[6,7,8]。本课题组在前期研究[9,10,11]的基础上，应用巢式RT-PCR技术对2011年5月至2015年8月收住汕头大学医学院第二附属医院儿科1 410例患儿的咽拭子行肠道病毒检测，确定肠道病毒分型，并对其中临床诊断为重症手足口病病例的病原学进行分析，报道如下。
收集2011年5月至2015年8月临床符合住院标准且入住汕头大学医学院第二附属医院儿科的手足口病患儿咽拭子标本1 410份，并收集患儿的临床资料，包括年龄、性别、症状、体征及相关辅助检查等。
住院患儿来源于潮汕地区，包括汕头市、潮州市、揭阳市和汕尾市四个地级市及周边地区。按照国家卫生部发布的《手足口病诊疗指南(2010年版)》[1]及《肠道病毒71型(EV71)感染重症病例临床救治专家共识》[2]制定临床诊断标准，这些患儿均已排除如水痘、麻疹、丘疹性荨麻疹、幼儿急疹等诊断明确的出疹性疾病。
1 410例手足口病患儿中，临床诊断重症手足口病321例(22.77%，321/1 410)。本研究已获得医院伦理委员会同意[批准号：汕大医附二伦审科(2010－01号)]，标本收集前均取得患儿家属许可并签署知情同意书。
患儿住院2 h内用无菌的聚酯纤维塑料柄拭子采集双侧后咽和扁桃体部位分泌物，采集后立即将咽拭子装入含有3 ml病毒运输培养液的无菌小瓶中，置于－80 ℃冰箱中待检。
病毒DNA/RNA提取试剂盒购于美国Axygen公司，严格按照说明书操作，提取所得的DNA/RNA置于－80 ℃冰箱保存备用。
肠道病毒通用诊断引物由国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心(厦门大学)提供。先对标本行RT-PCR扩增，再应用Transgen公司生产的2×TransTaq High Fidelity Mix对RT-PCR产物行5′UTR区巢式PCR扩增，检测病毒RNA。具体操作按试剂盒说明执行，实验过程中建立阳性对照和阴性对照。
对肠道病毒巢式RT-PCR扩增后的阳性产物行基因测序，5′UTR扩增的阳性产物片段为389 bp，收集肠道病毒检测阳性标本第二轮PCR扩增产物40 μl，送上海英潍捷基贸易有限公司纯化和测序，将所测序列递交美国国立生物技术信息中心(NCBI)基因库进行nBLAST比对，确定肠道病毒分型。
收集手足口病患儿的年龄、性别、临床症状、特殊体征、实验室检查、入出院日期等临床资料，并加以数据统计。
应用SPSS 21.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(
±s)表示，构成比的比较采用χ2检验：最小期望频数>5的样本比较采用Person卡方检验，最小期望频数≤5的样本比较采用Fisher精确检验，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。采用Spearman相关系数进行等级相关分析，相关系数Rs>0.7为高度相关，0.4<Rs<0.7为中度相关，Rs<0.4为低度相关。
2011至2015年我院收治的住院手足口病患儿1 410例中，肠道病毒阳性病例共782例(782/1 410，55.46%)，临床诊断为重症手足口病321例(22.77%，321/1 410)，其余1 089例(77.23%，1 089/1 410)为非重症手足口病。
321例临床诊断重症手足口病病例中，肠道病毒阳性共216例(67.29%，216/321)。其中EV71阳性116例(116/216，53.70%)，柯萨奇A组(coxsackievirus A，CA)16型(CA16)阳性43例(43/216，19.91%)，CA6阳性26例(26/216，12.04%)，CA10阳性19例(19/216，8.80%)，CA4阳性7例(7/216，3.24%)，柯萨奇B组5型(CB5)阳性2例(2/216，0.93%)，埃可病毒6型阳性1例(1/216，0.46%)，未分型2例(2/216，0.93%)。
321例重症手足口病病例中，5例诊断为危重症手足口病，病原检测均为EV71阳性。
EV71阳性患儿以重症病例为主(51.79%)，非重症病例EV71阳性率为48.21%；非EV71阳性病例以非重症病例为主(82.08%)，重症病例占17.92%，见表1。EV71阳性与非EV71阳性病例比较，差异有统计学意义(χ2＝91.68，P<0.001)。
EV71与手足口病轻重程度的关系[例(%)]
EV71与手足口病轻重程度的关系[例(%)]
| 组别 | 例数 | 非重症病例 | 重症病例 |
|---|---|---|---|
| EV71阳性病例 | 224 | 108(48.21) | 116(51.79) |
| 非EV71阳性病例 | 558 | 458(82.08) | 100(17.92) |
| 肠道病毒阳性病例 | 782 | 566(72.40) | 216(27.60) |
注：EV71：肠道病毒71型。
2011至2013年，EV71阳性率均高于当年重症手足口病比例；而2014和2015年，重症手足口病比例高于EV71阳性率，见表2、图1，说明非EV71的肠道病毒感染所致的重症手足口病逐渐上升。
2011至2015年病原学阳性病例中EV71及重症手足口病构成比[例(%)]
2011至2015年病原学阳性病例中EV71及重症手足口病构成比[例(%)]
| 项目 | 总病原学阳性例数 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 2011年(n＝110) | 2012年(n＝222) | 2013年(n＝238) | 2014年(n＝164) | 2015年(n＝48) | |
| EV71阳性 | 24(21.82) | 91(40.99) | 29(12.18) | 79(48.17) | 1(2.08) |
| 重症手足口病阳性 | 11(10.00) | 57(25.68) | 22(9.24) | 117(71.34) | 9(18.75) |
注：EV71：肠道病毒71型。
EV71：肠道病毒71型
2014年出现EV71感染暴发(占当年病原比例的48.17%)，重症病例也大幅上升至71.34%，高于EV71阳性率，说明部分非EV71的病毒感染也能发展为重症手足口病；2015年EV71流行减少，仅占当年病毒检测病原的2.08%，以非EV71病毒为主(97.92%)，重症病例下降至18.75%，但仍高于EV71阳性病例，见表2、图1，再次说明部分非EV71的病毒感染所致的手足口病也能出现重症病例。
对两组数据行Spearman等级相关分析发现差异有统计学意义(Rs＝0.9，P＝0.037)，说明重症手足口病构成比逐年改变的趋势与EV71阳性率改变趋势一致，且两者高度相关。
手足口病自1998年在中国台湾暴发而引起人们重视，2008年在中国内地出现流行，2009年及2010年全国手足口病的发病及重症死亡例数更明显升高。我国2011至2014年手足口病发病例数逐年上升，到2015年手足口病报告病例数较前下降。而重症手足口病患儿病情凶险，进展迅速。
关于重症手足口病的病原学，目前大部分研究认为EV71仍然是引起重症手足口病的主要病原体[12]。有报道指出，近年亚洲-太平洋地区暴发的重症手足口病主要由EV71感染引起[13,14,15]。甚至有研究显示，超过80%的重症病例和超过90%的死亡病例都是由EV71引起的[15]。我国卫生部已于2011年组织临床专家组总结2008年以来重症手足口病诊治经验，制定了EV71感染所致的重症手足口病的临床救治共识，其中强调重症手足口病大多由EV71病毒引起[2]。本研究分析粤东地区重症手足口病病原分布时发现，2011至2015年5年间重症手足口病的病原以EV71为主，占53.70%(116/216)，与大部分研究的主流观点一致。本研究还发现，在EV71阳性率升高的年份，重症手足口病的比例也相应上升，而EV71阳性率下降的年份，重症手足口病的比例也相应下降，统计学分析发现重症手足口病比例逐年改变的趋势与EV71阳性率改变趋势一致，且两者高度相关，说明在EV71成为优势病原的年份，重症手足口病的构成比相应上升。EV71感染多发生于春夏季节，患儿及带毒者为传染源。因其为嗜神经细胞病毒，累及神经系统的主要表现为急性无菌性脑膜炎、脑干脑炎、小脑炎、脊髓灰质炎样肌麻痹、吉兰-巴雷综合征、合并脑疝的致死性脑炎，其所致神经系统并发症可导致死亡或永久性肌麻痹。除了EV71，近几年也陆续出现了其他类型肠道病毒引起重症手足口病的报道。广州地区的报道指出，部分无菌性脑膜炎病例与CA6有关[16,17]。Feder等[8]也指出，CA6能引起重症手足口病。而重庆、河南、山东、济南等地的报道显示，CA10可能引起重症手足口病[6,7]。上海地区的报道指出，CA16和其他类型的肠道病毒也能引起重症手足口病，且CA16引起重症手足口病的比例明显高于其他类型的肠道病毒[18]。本研究结果显示，除了EV71之外，重症手足口病的病原体还有CA16、CA6、CA10、CA4、CB5、埃可病毒6型。其中CA16比例最高，其次是CA6。虽然本地区重症手足口病的病原仍以EV71为主，但非EV71肠道病毒，如CA16、CA6、CA10等病毒感染所致的重症病例比例及数量仍不在少数，需引起重视。我们除了关注EV71所引起重症手足口病的临床特点，也需要注意其他类型的肠道病毒所致的重症手足口病。
通过对图1分析还发现，在2011、2012及2013年，EV71比例都高于当年重症手足口病的比例，而在2014年和2015年，重症手足口病比例高于EV71感染的比例，说明非EV71的肠道病毒感染所致的重症手足口病比例逐渐上升。近几年报道陆续指出，各地各型别肠道病毒的流行趋势在发生变化，且不同地区不尽相同[19,20,21]。非EV71的肠道病毒感染所致的重症手足口病比例逐渐上升，除了肠道病毒流行趋势的改变外，究其原因，一方面可能与部分患儿对EV71产生了抗体有关，另一方面可能随着检测技术和方法的进步，检测阳性率进一步提高，且能检测出的肠道病毒型别更多。这也提醒我们需要重视对其他类型肠道病毒的监测和研究。
按照《肠道病毒71型(EV71)感染重症病例临床救治专家共识》(2011年版)对手足口病的临床分期，第3期(心肺功能衰竭前期)和第4期(心肺功能衰竭期)的病例属于手足口病重症病例危重型。目前，国内外对危重型手足口病的病原学研究结果显示，绝大部分以EV71感染为主[5,18,22,23]。我国湖南省的研究结果显示，危重症手足口病88.78%由EV71感染引起[5]。本研究5例为危重型手足口病，病原检测均为EV71阳性，与相关研究结果一致。关于EV71易引起危重症病例的病理生理机制，目前仍然是国内外研究的热点。部分观点认为，因EV71有高度嗜神经性，易侵犯脑干的心血管及呼吸调节中枢，引起颅内压升高，交感神经兴奋，大量儿茶酚胺释放，最终导致心肺功能衰竭而死亡[24]。如何提高危重症病例的抢救成功率，仍然是我们需要不断探讨的方向。
我国经过近6年的手足口病流行，对手足口病的治疗水平显著提高，但危重症手足口病易出现死亡病例。而本研究中，危重症手足口病病原体均为EV71，其他病原体虽然也可能导致危重症手足口病，但比例仍在少数。因此，积极发展快速肠道病毒分型的诊断技术迫在眉睫。
本研究中，重症手足口病肠道病毒检测阳性率67.29%，仍有约1/3的病例未检测出致病原，一方面，可能由于实验技术水平限制，部分其他类型肠道病毒尚未能检出；一方面由于存在实验误差，可能存在假阴性。随着医学检验技术的发展，越来越多的病原体被发现，手足口病患儿如能早期明确其病原学分型，有利于结合各型病原体手足口病特点，早期发现重症病例，早期干预，提高危重症手足口病抢救成功率。
综上所述，2011至2015年潮汕地区重症手足口病病原构成以EV71为主，其他类型的肠道病毒如CA16、CA6、CA10、CA4、CB5和埃可病毒6型也能引起重症手足口病。危重症病例均由EV71引起。在EV71成为优势病原的年份，重症手足口病的构成比相应上升。2013年以后，非EV71的肠道病毒感染所致的重症手足口病比例逐渐上升。因此，除了EV71，加强对其他型别肠道病毒的监测和研究也迫在眉睫。
