应用血栓弹力图(thrombelastography，TEG)评估川崎病患儿抗血小板药物治疗的效果。
回顾性分析2016年5月至2016年12月收治的川崎病患儿的临床资料，采用血栓弹力图-血小板图(TEG-platelet maping，TEG-PM)检测花生四烯酸(arachidonic acid，AA)途径血小板抑制率(AA%)及二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)途径血小板抑制率(ADP%)，比较阿司匹林及双嘧达莫对血小板抑制效应的差异及不同TEG检测时间、阿司匹林用量对血小板抑制率的影响。
阿司匹林及双嘧达莫对血小板的抑制作用存在明显个体差异。阿司匹林对血小板的抑制率[M(P25，P75)]62.45%(35.58%，90.95%)高于双嘧达莫对血小板的抑制率23.75%(11.60%，48.38%)，差异具有统计学意义(P<0.01)。川崎病患儿双嘧达莫抵抗的发生率(56.75%)高于阿司匹林抵抗的发生率(35.71%)，差异具有统计学意义(P<0.01)。川崎病患儿应用两种抗血小板药物的血小板抑制率存在线性相关(r＝0.351，P<0.01)。阿司匹林及双嘧达莫用药4 d后，用药时间长短对血小板抑制率的影响差异无统计学意义，阿司匹林不同剂量对AA%的影响差异无统计学意义。
TEG是一项可以有效评估川崎病患儿抗血小板药物疗效的手段。
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川崎病是一种以急性发热、皮肤黏膜损害和局部淋巴结肿大为临床表现的血管炎性疾病，其导致的心脏及冠状动脉损害已成为儿童最常见的获得性心脏病[1,2]。在川崎病急性期及合并冠状动脉病变的患儿中应用阿司匹林或联合双嘧达莫已经成为川崎病后抗血小板治疗的标准方案[1,3,4]。然而，环境、临床及遗传基因变异等多种因素可导致患者服用抗血小板药物的反应存在异质性[5]。研究发现，人群中存在阿司匹林、氯吡格雷的药物抵抗现象[6,7,8]，即抗血小板药物不能有效抑制血小板活性，而血小板活性不能得到充分抑制可导致抗血小板治疗后缺血事件的再发生。因此，在川崎病患儿的治疗和随访中，评估患儿对抗血小板药物的反应，指导个体化抗血小板治疗存在必要性。血栓弹力图(thrombelastography，TEG)是一种用于检测全血样本凝血状态的方法，其血小板图(TEG-Platelet mapping，TEG-PM)可以通过检测相关药物的血小板抑制率评估抗血小板药物作用。本研究应用TEG-PM对确诊川崎病并应用双联抗血小板药物的患儿进行血小板抑制率检查，评价川崎病患儿应用阿司匹林、双嘧达莫的抗血小板效果，为川崎病患儿抗血小板治疗选择提供一定的依据。
(1)入选标准：2016年5月至2016年12月收治住院的川崎病患儿。川崎病采用2010年日本循环协会发布的川崎病诊断标准[3]。患儿出现以下6条临床表现中的5条：①持续发热超过5 d(包括经治疗后5 d以内退热者)；②双眼结膜充血；③口唇潮红、草莓舌、口腔及咽部黏膜弥漫性充血；④多形性红斑、皮疹；⑤急性期手足硬性肿胀、掌跖及指趾端红斑，恢复期指趾端甲床膜状脱皮；⑥急性期颈部淋巴结非化脓性肿胀；可诊断川崎病。或出现4条上述临床表现但经超声心动图或心血管造影检查证实存在冠状动脉扩张或冠状动脉瘤，除外其他疾病后，也可确诊为川崎病。(2)冠状动脉扩张的诊断标准[1]：心脏超声检查任一节段冠状动脉内径Z值≥2.0。(3)排除标准：①合并原发性出凝血障碍、严重感染的KD患儿；②病前应用抗凝、抗血小板药物及输注血浆、血小板等血制品及糖皮质激素的川崎病患儿；③不完全川崎病患儿；④TEG-PM检查前因各种原因中断两种或其中一种抗血小板药物的KD患儿。
患儿确诊川崎病后即刻应用丙种球蛋白(2 g/kg)治疗，同时予阿司匹林及双嘧达莫口服，阿司匹林用药剂量3～50 mg/(kg·d)，双嘧达莫用药剂量3～5 mg/(kg·d)。
采用美国Haemoscope公司生产的Thrombelastography Analyser-5000及配套的检测杯(普通杯、肝素酶杯和高岭土管)、试剂[激活剂：氯化钙(CaCl2)，二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)，花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，激活剂F(蝮蛇血凝酶和血小板ⅩⅢa因子混合物)，蒸馏水]。
全部患儿川崎病确诊即开始口服阿司匹林及双嘧达莫片，用药不短于4 d后抽取静脉血4 ml，分别置于枸橼酸钠取血管和肝素取血管中。
取血后2 h内完成TEG-PM检测，分别使用TEG凝血分析仪的4个通道检测血凝块最大振幅(maximum amplitude，MA)值：1通道MA代表由凝血酶诱导的最大血凝块强度(MAthrombin)；2通道MA代表缺少凝血酶和血小板激活状态下纤维蛋白形成最大血凝块强度(MAfibrin)；3通道代表纤维蛋白网和未被相应阿司匹林抑制的血小板形成的最大血凝块强度(MAAA) ；4通道MA代表纤维蛋白网和未被相应双嘧达莫抑制的血小板形成的最大血凝块强度(MAADP) 。
根据MAthrombin，MAfibrin，MAAA，MAADP计算血小板抑制率。AA途径血小板抑制率(AA%)＝(MAthrombin－MAAA)/(MAthrombin－MAfibrin)×100%，反映阿司匹林对血小板的抑制作用；ADP途径血小板抑制率(ADP%)＝(MAADP－MAfibrin)/(MAthrombin－MAfibrin)×100%，反映双嘧达莫对血小板的抑制作用。
TEG检查中由2 μmol/L ADP诱导的血小板聚集率>70%，即血小板抑制率≤30%提示存在氯吡格雷、双嘧达莫药物抵抗。由1 mmol/L AA诱导的血小板聚集率>50%，即血小板抑制率≤50%提示存在阿司匹林药物抵抗。
根据用药后TEG检测时间分3组：(1)4～7 d组；(2)8～14 d组；(3)>14 d组。
根据阿司匹林用药剂量分3组：(1)3～5 mg/(kg·d)；(2) 5～30 mg/(kg·d)；(3) 30～50 mg/(kg·d)。
使用SPSS 24.0统计软件进行统计分析。计量资料中非正态分布资料采用中位数(四分位数间距)[M(P25，P75)]表示，两组间比较采用非参数秩和检验；计数资料用频数及百分率表示，两组间比较采用卡方检验。相关性采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
本研究共纳入符合入选标准的患儿297例，1例患儿因原发凝血障碍(血友病A)，15例患儿因合并严重感染，29例患儿因药疹、肝功能损害终止双联抗血小板药物被剔除。最终纳入川崎病患儿252例，其中男138例，女114例；年龄分布3个月至14岁，中位年龄2岁8个月；完全川崎病238例，不完全川崎病14例；冠状动脉正常169例，冠状动脉扩张58例，冠状动脉瘤25例。
(1)川崎病患儿应用抗血小板药物后检测的血小板抑制率呈偏态分布。AA%呈正偏态分布，ADP%呈负偏态分布(图1)。
(2)服用阿司匹林后TEG检测的AA%为62.45%(35.58%，90.95%)，服用双嘧达莫后TEG检测的ADP%为23.75%(11.60%，48.38%)，两种药物对血小板的抑制作用差异具有统计学意义，阿司匹林强于双嘧达莫(P<0.01)。川崎病患儿双嘧达莫抵抗的发生率(56.75%)高于阿司匹林抵抗的发生率(35.71%)，两种药物抵抗发生率差异具有统计学意义(P<0.01)。
(3)川崎病患儿抗血小板药物反应类型的分布：患儿阿司匹林及双嘧达莫均存在药物抵抗的患儿共71例，占全部患儿的28.17%，阿司匹林敏感、双嘧达莫抵抗的患儿共72例，占全部患儿的28.57%，阿司匹林抵抗、双嘧达莫敏感的患儿共19例，占全部患儿的7.54%，共同敏感的患儿共90例，占全部患儿的35.71%。
阿司匹林抵抗患儿90例，服用双嘧达莫的ADP%为19.10%(9.80%，40.70%)。阿司匹林敏感患儿162例，服用双嘧达莫的ADP%为40.8%(18.4%，60.1%)。阿司匹林抵抗患儿应用双嘧达莫的ADP%低于阿司匹林敏感患儿应用双嘧达莫的ADP%，差异具有统计学意义(P<0.01)。双嘧达莫抵抗患儿143例，服用阿司匹林的AA%为51.90%(28.50%，81.40%)。双嘧达莫敏感患儿109例，服用阿司匹林的AA%为81.30%(55.80%，93.70%)。双嘧达莫抵抗患儿服用阿司匹林的AA%低于双嘧达莫敏感患儿服用阿司匹林的AA%，差异具有统计学意义(P<0.01)。患儿应用两种抗血小板药物的血小板抑制率存在线性相关关系，但相关程度较弱(r＝0.351，P<0.01)。
阿司匹林、双嘧达莫用药4 d后，继续用药对血小板抑制率的影响差异无统计学意义(表1)。
不同服药时间ADP、AA途径血小板抑制率的比较[M(P25，P75)，%]
不同服药时间ADP、AA途径血小板抑制率的比较[M(P25，P75)，%]
| 用药时间 | 例数 | ADP途径血小板抑制率 | AA途径血小板抑制率 |
|---|---|---|---|
| 4～7 d | 187 | 23.50(13.88，46.55) | 61.40(35.85，89.30) |
| 8～14 d | 34 | 19.50(11.93，41.05) | 59.95(33.40，89.63) |
| >14 d | 31 | 19.90(6.83，43.43) | 86.40(46.30，93.10) |
| P值 | 0.413 | 0.215 |
阿司匹林用量在3～5 mg/(kg·d)患儿的AA%为77.40%(42.75%，92.40%)，用量在5～30 mg/(kg·d)患儿的AA%为55.70%(30.90%，70.50%)，用量在30～50 mg/(kg·d)患儿的AA%为64.30%(35.70%，91.33%)。不同用量阿司匹林对AA%的影响差异无统计学意义(P＝0.106)。阿司匹林剂量与AA%不具有相关性(r＝－0.084，P＝0.230)。
阿司匹林、双嘧达莫是临床上最常应用的抗血小板药物，其分别通过抑制环氧化酶-1(COX-1)，减少血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)生成[11]和抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)活性，增加环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)浓度，降低血小板内游离钙浓度而达到抑制血小板凝聚功能的作用。然而临床实践中发现，尽管患者规律服用抗血小板药物，仍有可能发生动脉血栓的事件。这种应用抗血小板药物无效的现象逐渐为越来越多临床医生所关注，并被一些研究者定义为抗血小板药物抵抗。
川崎病患儿应用阿司匹林、双嘧达莫抗血小板治疗是川崎病治疗的重要环节，但目前罕有评估川崎病患儿血小板功能及抗血小板药疗效方面的研究。儿科医师用药往往根据川崎病患儿的血小板计数、常规凝血功能的检查估计其出凝血状态并参考川崎病指南推荐剂量用药。而单纯的凝血功能检查及血小板计数并不能全面反映复杂的凝血状态、血小板功能及抗血小板药物疗效。因此，对于规范应用抗血小板药物仍发生冠状动脉血栓的川崎病患儿，应警惕其存在抗血小板药物抵抗的可能。评估川崎病患儿血小板功能及抗血小板药物疗效存在必要性。
目前临床上应用于检测血小板功能的方法包括光透射血小板聚集法(比浊法，LTA)、电阻抗法血小板聚集度测定、尿11-脱氢血栓素B2测定、血小板功能测定仪(PFA-100)、快速血小板功能分析仪、流式细胞仪法、锥形板血小板分析仪、Verify Now system及TEG[12]。TEG由德国人Hartert在1948年发明[13]，是一种根据血凝块强度的变化来整体评价患者凝血、纤溶过程的检查方法。相比常规凝血功能检测，能通过相应检测结果及TEG曲线全面反映包括血小板功能的凝血状态，已成为临床常用的出凝血功能的床旁检测工具。应用TEG-PM则可进一步通过检测血小板抑制率评价抗血小板药物治疗人群的血小板功能以及药物疗效。相较于临床上其他血小板功能检测方法，TEG-PM在检测血小板功能的敏感性、重复性、稳定性、操作易行性等方面存在一定优势[14]，可以分别检测反映阿司匹林抗血小板作用的AA途径血小板抑制率和氯吡格雷抗血小板作用的ADP途径血小板抑制率，并根据TEG检测的AA%<50%及ADP%<30%定义阿司匹林、氯吡格雷抵抗。目前已在冠状动脉心脏病患者评估抗血小板药物作用，预测经皮冠状动脉介入治疗术后患者再栓塞及出血，指导抗血小板药物选择等方面得到了广泛的认可[15]，可以作为评价抗血小板药物作用的客观评价指标。双嘧达莫作为PDE抑制剂，可抑制PDE的活性和腺苷酸的摄取，虽与氯吡格雷的作用位点(ADP受体)不同，但由于两种药物最终途径均为通过增加血小板内cAMP浓度，降低血小板内游离钙浓度而发挥抑制血小板聚集的作用，因此双嘧达莫也可以通过检测ADP%达到评估其抑制血小板功能的作用。
本研究应用TEG-PM方法检测川崎病患儿应用阿司匹林及双嘧达莫后的血小板聚集抑制率，证明两种抗血小板药物存在明显的血小板抑制率差异性，应用阿司匹林的血小板抑制率明显高于双嘧达莫(P<0.01)。阿司匹林抵抗的发生率低于双嘧达莫(35.71%比56.75%，P<0.01)，提示目前常规剂量下阿司匹林的抗血小板作用优于双嘧达莫。这也为阿司匹林仍为目前川崎病患儿首选的抗血小板药物提供了依据。本研究中，阿司匹林抵抗率35.71%，高于部分成人冠状动脉心脏病领域的相应研究，考虑这种情况的出现与川崎病炎症相关的非血小板源性TXA2释放增多有关[16]。
本研究全部252例川崎病患儿均同时服用阿司匹林及双嘧达莫抗血小板治疗，两种药物同时存在抵抗的病例共71例，占全部患儿的28.27%。阿司匹林抵抗组患儿服用双嘧达莫的ADP%低于敏感组患儿的ADP%(P<0.01)，双嘧达莫抵抗组患儿服用阿司匹林的AA%低于敏感组患儿的AA%(P<0.01)，这提示两种药物联用仍存在抗血小板聚集效果不足的可能。阿司匹林抵抗时，其他血小板激活途径所致的血小板聚集功能也会增强，造成ADP%下降，与既往研究相一致[17]。
达到稳定血药浓度的时间不仅仅取决于该药物剂量及药物代谢半衰期，还与胃肠吸收率及肝脏首过效应等众多复杂因素相关。不同剂量下阿司匹林的半衰期也存在差异，故目前川崎病患儿抗血小板药物达到稳定血药浓度并发挥稳定抗血小板作用的时间并不明确。本研究比较了不同服药时间对AA%及ADP%的影响，发现在服用阿司匹林及双嘧达莫4 d后的不同时间检测TEG-PM，检测结果差异无统计学意义。该结果提示，4 d规律服药可以使患儿血药浓度达到稳态从而使抗血小板药物的药效达到稳定状态。
目前川崎病患儿应用阿司匹林治疗的剂量并无统一标准[18]。本研究发现，不同阿司匹林用量对AA%影响无差异，阿司匹林剂量与AA%不具有相关性。这一发现与Gurbel等[19]的研究相一致。提示增加阿司匹林用量并不能增强其抗血小板作用。因此，在川崎病炎症控制后，及时减少阿司匹林用量，有可能在保证相同的抗血小板效果的同时，降低大剂量阿司匹林所造成的胃肠反应等不良反应。
研究显示，即使在川崎病发病后数月到数年，患儿的血小板凝聚功能仍高于正常同龄儿[20,21]。因此，维持川崎病患儿恢复期有效的抗血小板治疗仍可能必要。由于缺乏长期随访TEG数据，本研究尚不能对川崎病患儿血小板功能增强的持续时间做出评价。
综上所述，应用TEG可以评估川崎病患儿对抗血小板药物反应的个体差异，发现对抗血小板药物不敏感的患儿，从而有可能在今后为临床医生制定个体化的治疗方案提供依据和参考，对于合并存在冠状血栓高危风险的患儿可能更有价值。推荐TEG作为评价川崎病患儿血小板功能及抗血小板药物效力的临床指标。
