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布拉氏酵母菌对炎症性肠病小鼠白细胞介素-17，白细胞介素-10，转化生长因子-β1表达的影响
中国小儿急救医学, 2018,25(10) : 757-761. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2018.10.010
摘要
目的

探讨布拉氏酵母菌(SB)对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导炎症性肠病(IBD)小鼠白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素10(IL-10)及转化生长因子β1 (TGF-β1)表达的影响。

方法

将Balb/c雌性小鼠随机分成3组：对照组、TNBS组和TNBS＋SB组。应用TNBS诱导方法建立小鼠IBD模型(TNBS组)：直肠灌注5% TNBS 0.1 ml/只＋50%乙醇溶液0.1 ml/只连续5 d，灌肠后第2天开始生理盐水0.1 ml/只灌胃，连续2周；TNBS＋SB组：直肠灌注5% TNBS 0.10 ml/只＋50%乙醇溶液0.10 ml/只连续5 d，灌肠后第2天开始SB (SB不少于109 CFU/ml) 0.1 ml/只灌胃，连续2周；对照组：直肠灌注50%乙醇溶液0.20 ml/只连续5 d，灌肠后第2天开始生理盐水0.1 ml/只灌胃，连续2周。第15天观察小鼠一般状态，收集外周血，处死小鼠后收集结肠组织行HE染色；ELISA法、免疫组化法分别检测外周血和结肠组织中IL-17、IL-10、TGF-β1的表达水平。

结果

TNBS组小鼠外周血及结肠组织中IL-17较对照组均明显增高(P<0.05)，而IL-10、TGF-β1较对照组明显降低(P<0.05)。TNBS＋SB组较TNBS组外周血及结肠组织中IL-17水平下降(P<0.05)，IL-10和TGF-β1水平升高(P<0.05)；与对照组比较外周血及结肠组织中IL-17水平仍上升(P<0.05)，IL-10和TGF-β1水平下降(P<0.05)。

结论

IBD发生时外周血及结肠组织中细胞因子IL-17表达升高，IL-10、TGF-β1表达下降。SB可能通过平衡IL-17、IL-10、TGF-β1表达来改善IBD的肠道炎症反应。

引用本文: 王瑰娜, 毛志芹. 布拉氏酵母菌对炎症性肠病小鼠白细胞介素-17，白细胞介素-10，转化生长因子-β1表达的影响 [J] . 中国小儿急救医学, 2018, 25(10) : 757-761. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2018.10.010.
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炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的基本特征及病理改变是慢性肠道炎症，它包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，其发病率近年来持续上升，尤其是儿童及青少年[1]。目前发病机制尚不清楚，包括遗传易感宿主和环境的复杂相互作用，肠黏膜屏障破坏，免疫应答功能异常以及肠道微生物失衡[2]。其中免疫功能紊乱在IBD的发病中起着至关重要的作用。T辅助淋巴细胞17(T helper 17 cell，Th17)是近年来发现的CD4＋细胞亚群，通过效应细胞因子白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)诱导机体产生强烈的免疫炎症反应[3]，T调节细胞(regular T cell，Treg)可以抑制免疫炎症反应，白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)和转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是其发挥作用的主要效应分子。促炎因子与抗炎因子的失衡，不利于机体免疫稳态的维持，与IBD的发病密切相关。

IBD治疗上多应用激素及免疫抑制剂治疗，但药物不良反应大，疗程长，易复发。近年来生物制剂在临床上已广泛应用，疗效显著，但治疗费用昂贵。布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii，SB)为临床上常用益生菌，是一种真菌制剂，不受抗生素、胃酸、胆汁的影响。近年来学者对SB的应用价值进行了大量的基础和临床研究，结果表明，SB作为辅助药物应用于IBD的治疗取得了较好的临床效果[4,5,6]。然而SB帮助减轻肠道炎症的机制尚不明确。本研究通过ELISA法和免疫组化法检测IBD小鼠及SB干预后其外周血和结肠组织中IL-17、IL-10、TGF-β1的表达，旨在探讨IBD时细胞因子IL-17、IL-10、TGF-β1的变化以及SB协助减轻IBD的可能发生机制。

1　材料与方法
1.1　实验方法

简单随机法将30只4～6周龄、体重16～20 g BALB/c雌性小鼠(中国医科大学附属盛京医院中心实验室提供)分成对照组、TNBS组和TNBS＋SB组，每组10只。TNBS组：直肠灌注5%三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulphonic acid，TNBS，沈阳宝信生物公司) 0.1 ml/只＋50%乙醇溶液0.1 ml/只连续5 d，灌肠后第2天开始生理盐水0.1 ml/只灌胃，连续2周；TNBS＋SB组：直肠灌注5% TNBS 0.1 ml/只＋50%乙醇溶液0.1 ml/只连续5 d，灌肠后第2天开始SB(法国百科达制药厂，SB不少于109 CFU/ml)0.1 ml/只灌胃，连续2周；对照组：直肠灌注50%乙醇溶液0.2 ml/只连续5 d，灌肠后第2天开始生理盐水0.1 ml/只灌胃，连续2周。在造模的第15天观察小鼠情况，留取外周血，将全部小鼠处死，收集结肠组织行HE染色。

1.2　ELISA法检测IL-17、IL-10、TGF-β1浓度

严格按照ELISA试剂盒说明书步骤，设标准孔、待测样品孔、空白孔，分别加样，37 ℃温育1 h，洗板5次，加入A、B显色液，37 ℃温育30 min，然后加入终止液终止，利用酶标仪按照450 nm波长测量各孔的光密度，最终得出相应的样品浓度。

1.3　免疫组化法检测IL-17、IL-10、TGF-β1表达水平

严格按照免疫组化步骤说明书进行。随机选取每只小鼠3张结肠切片，切片常规脱蜡水化，3% H2O2去离子水阻断30 min，进行抗原修复，山羊血清封闭30 min，滴加一抗(兔抗人IL-17多克隆抗体，兔抗人IL-10多克隆抗体，鼠抗人TGF-β1单克隆抗体)，一抗4 ℃过夜，生物素标记山羊抗兔IgG 37 ℃温箱孵育40 min，辣根酶标记链酶卵白素37 ℃温箱孵育15 min，DAB显色，然后复染、脱水、透明、封片光镜下观察。对照组用PBS代替一抗，步骤同前。每张切片随机选取5个以上的高倍镜视野，应用NIS-Elements Br3.0图像分析软件计算出平均灰度值(Mean Density)作为该片蛋白半定量结果。

1.4　统计学处理

采用SPSS 21.0软件行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD统计学方法，计量资料符合正态分布，以均值±标准差(±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　各组结肠组织病理改变

在光学显微镜下观察，TNBS组小鼠均有结肠炎症改变，表现为黏膜及黏膜下层溃疡、糜烂和大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润；对照组小鼠无以上炎症表现，提示造模成功[7]；而SB干预后，小鼠仅表现为少量炎性细胞浸润，轻度中性粒细胞和淋巴细胞浸润，提示SB减轻了肠道炎症。见图1。

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图1
各组小鼠结肠组织病理形态学变化(苏木素-伊红染色，×200)
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A．TNBS组；B.TNBS＋SB组；C.对照组

图1
各组小鼠结肠组织病理形态学变化(苏木素-伊红染色，×200)
2.2　IL-17、IL-10、TGF-β1在IBD小鼠外周血浓度差异及SB干预作用

TNBS组外周血IL-17浓度与对照组相比上升，差异有统计学意义(P<0.05)；TNBS＋SB组外周血IL-17浓度与TNBS组相比下降，与对照组相比上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。TNBS组外周血IL-10、TGF-β1浓度与对照组相比均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；TNBS＋SB组IL-10、TGF-β1浓度与TNBS组相比均上升，与对照组相比均下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

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表1

各组小鼠外周血中IL-17、IL-10及TGF-β1浓度(±s，ng/ml)

表1

各组小鼠外周血中IL-17、IL-10及TGF-β1浓度(±s，ng/ml)

分组鼠数(只)IL-17IL-10TGF-β1
对照组1024.97±0.6188.96±4.7431.40±2.12
TNBS组1073.16±1.88a69.20±3.09a20.23±2.45a
TNBS＋SB组1051.73±1.33ab77.38±4.50ab26.31±1.09ab
F值 2 460.8545.3564.17
P值 <0.05<0.05<0.05

注：与对照组比较，aP<0.05；与TNBS组比较，bP<0.05。

2.3　IL-17、IL-10、TGF-β1在IBD小鼠结肠组织表达差异及SB干预作用

光镜下观察细胞因子IL-17、IL-10、TGF-β1染色均为棕色，主要为胞质和胞核着色，IL-10及TGF-β1在对照组小鼠结肠组织中表达最多，在TNBS组小鼠结肠组织中表达最少；而IL-17则在对照组小鼠结肠组织中表达最少，在TNBS组小鼠结肠组织中表达最多，见图2。

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图2
IL-17、IL-10及TGF-β1在各组小鼠结肠黏膜中的免疫组化表达(×200)
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DGJ为TNBS组，EHK为TNBS＋SB组，FIL为对照组；DEF为IL-17在小鼠结肠中表达，GHI为IL-10在小鼠结肠中表达，JKL为TGF-β1在小鼠结肠中表达。

图2
IL-17、IL-10及TGF-β1在各组小鼠结肠黏膜中的免疫组化表达(×200)

TNBS组小鼠结肠组织中IL-17平均灰度值高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；TNBS＋SB组结肠IL-17平均灰度值与TNBS组相比下降，与对照组相比上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。TNBS组结肠IL-10、TGF-β1平均灰度值与对照组相比均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；TNBS＋SB组结肠IL-10、TGF-β1平均灰度值与TNBS组相比上升，与对照组相比下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

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表2

IL-17、IL-10及TGF-β1在各组小鼠结肠组织中的平均灰度值(±s)

表2

IL-17、IL-10及TGF-β1在各组小鼠结肠组织中的平均灰度值(±s)

分组鼠数(只)IL-17IL-10TGF-β1
对照组10208.88±6.56354.25±6.41269.75±5.99
TNBS组10441.63±4.10a137.50±3.61a86.38±3.74a
TNBS＋SB组10306.13±7.34ab242.63±7.50ab167.63±3.2ab
F值 2 885.442 626.883 367.14
P值 <0.05<0.05<0.05

注：与对照组比较，aP<0.05；与TNBS组比较，bP<0.05。

3　讨论

IBD发病机制比较复杂，与多种因素相关，其中免疫功能紊乱为主要原因。近年来研究显示IBD的发生与Th17/Treg失衡密切相关。Th17和Treg是两种CD4＋T细胞亚群，之间存在着密切的关系，也可以相互转化。Th17具有诱导组织发生强烈炎症反应的功能特征，主要通过分泌细胞因子IL-17来完成。IL-17是免疫应答及后续炎症反应的起始，可介导炎性细胞因子的表达。Treg具有免疫无能性和抑制性两大功能特征，IL-10和TGF-β1是Treg发挥免疫抑制作用的主要细胞因子。

IL-17可以介导肠道炎症的发生。克罗恩病和溃疡性结肠炎患者的肠黏膜中IL-17和Th17细胞明显上调[8,9]。研究显示IL-17在IBD实验模型中有致病作用，例如在TNBS诱导小鼠结肠炎实验中，IL-17受体缺乏的小鼠结肠炎症改变较对照组小鼠减轻[10]，而IL-17则加重葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎[11]。同样，IL-17缺陷的动物被保护免于DSS诱导的小鼠结肠炎，IL-17受体缺陷小鼠的结肠病理改变也有所减轻，表明IL-17可能在促进鼠肠道慢性炎症方面具有重要的作用[12]。近年来的研究发现IL-10可以促进黏液产生，增强黏蛋白和杯状细胞修复，从而促进肠黏膜上皮细胞屏障的形成，起到了保护肠黏膜的作用。IL-10是人体免疫应答中最重要的抗炎细胞因子，在免疫调节和宿主防御中具有重要的作用[13]。IL-10不仅抑制促炎介质的产生，同时增加抗炎介质的生成[14]。已经观察到IL-10激活不同的细胞信号传导途径以发挥其抗炎作用，如通过JAK / STAT3或PI3K / Akt途径促进选定的免疫细胞增殖，IL-10还可以通过激活p38MAPK途径抑制巨噬细胞中的TNF-α产生[15]。IL-10基因敲除的小鼠可以作为IBD的动物模型[16]。TGF-β1在肠道广泛分布，可调节细胞的生长黏附迁移分化和凋亡，并在调节炎症反应，免疫稳态及免疫耐受中发挥重要作用。健康人肠道黏膜中TGF-β1受到抑制将会导致促炎性细胞因子的产生增加[17]。已发现高水平的TGF-β1抑制Th17细胞的分化，减少炎症因子的产生[18]。TGF-β1同时很可能与器官纤维化有关，在克罗恩病患者中导致肠腔狭窄和成纤维细胞过度表达。另有研究发现TGF-β1的组织水平在IBD的早期阶段短暂地减少，而在晚期疾病阶段则增加[19]，在IBD的慢性化中起主要作用。本研究结果发现，TNBS组小鼠外周血及结肠组织中细胞因子IL-17水平较对照组明显升高，IL-10水平较对照组明显下降，与既往研究结果相一致；而细胞因子TGF-β1水平低于对照组，考虑为IBD小鼠模型建立早期，TGF-β1此时发挥着免疫耐受及抑制炎症反应作用，肠道目前尚未出现纤维化，缺少慢性过程。

益生菌也叫作微生态调节剂、生态制品、活菌制剂，通过添加到食品中起到调节肠道微生态作用，是一种能够对人或动物产生有利影响的微生物[20]。SB是一种临床上广泛应用的活酵母菌[21]。目前大量的研究证实SB联合其他治疗药物应用于IBD的治疗取得了较好的临床效果。在一项针对31例缓解期克罗恩病患者的小规模试验性研究中，所有患者均持续使用维持性药物治疗，随机分为SB组和安慰剂组。与安慰剂组相比，SB组患者的结肠渗透性显著降低，细菌移位的风险降低[4]。在另一项针对缓解的32例克罗恩病患者的研究中，用SB治疗的患者复发率(6%)明显少于对照组(38%)[5] 。在一项针对6例溃疡性结肠炎患者的小规模试验性研究中，包含SB治疗3个月的治疗方案似乎能有效预防溃疡性结肠炎的早期复发[6]。目前研究发现SB针对宿主以及病原微生物有多种作用机制，包括调节肠道菌群的平衡，干扰病原体定植和感染黏膜的能力，调节局部和全身免疫应答，稳定胃肠屏障和功能，诱导有利于吸收和营养的酶活性[22]。本研究结果发现，TNBS组小鼠均有结肠炎症改变，表现为黏膜及黏膜下层溃疡、糜烂和大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润，提示IBD模型建立成功，而SB干预后，小鼠病理改变减轻，仅表现为少量炎性细胞浸润，轻度中性粒细胞和淋巴细胞浸润，提示SB对炎症具有治疗作用。SB＋TNBS组较TNBS组小鼠外周血及结肠组织中细胞因子IL-17水平下降，IL-10和TGF-β1水平升高，提示SB可以降低血清及组织中细胞因子IL-17，同时提高IL-10、TGF-β1水平，所以推测SB可能是通过维持促炎因子和抗炎因子的平衡来抑制炎症及免疫反应过程，从而减轻IBD的肠道炎症反应。其发生机制可能是由于SB可以抑制NF-KB信号传导途径减少炎症因子产生，增加抗炎因子过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)合成和促进肠系膜淋巴结T细胞的重新分配[23]。

综上所述，在IBD的发病过程中，促炎因子IL-17和抑炎因子IL-10、TGF-β1的免疫失衡发挥着重要的作用，SB可以调节促炎因子IL-17和抑炎因子IL-10、TGF-β1的平衡，维持机体稳态，为临床探索新的IBD辅助治疗方案提供了理论依据。

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