探讨病原体快速检测技术在儿童重症肺炎中的应用。
2017年1月至2018年6月，对我院PICU收治的重症社区获得性肺炎患儿入PICU 24 h内进行痰液病毒和支原体检测，对其中65例患儿痰样本采用呼吸道测试条(respiratory panel，R-Panel)进行自动巢式多重聚合酶链反应检测17种呼吸道病原，并与常规方法(免疫荧光及胶体金试验)比较。
65例重症肺炎患儿病原学检测结果：(1)常规方法检测总体阳性率23.08%(15/65)，共获取病原15例次，其中病毒阳性13例次、肺炎支原体阳性2例次。(2)R-Panel 2 h内获取检测结果，总阳性率为58.46%(38/65)，共获得病原51例次，包括病毒46例次、支原体5例次；其中，人鼻病毒/肠病毒检出率最高，占23.08%(15/65)；其次，腺病毒检出阳性率为15.38%(10/65)；12例患儿同时检测出2种或2种以上病原菌，检出阳性率为18.46%(12/65)；(3)R-Panel检测腺病毒阳性率显著高于常规方法(15.38 %比4.62%，χ2＝4.188，P＝0.041)；R-Panel检测腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3型、肺炎支原体灵敏度明显高于常规方法(100.00%比30.00%，χ2＝107.692；50.00%比16.67%，χ2＝24.442；100.00%比80.00%，χ2＝22.222；100.00%比40.00%，χ2＝85.714)，差异均有统计学意义(P均<0.001)。
R-Panel进行自动巢式多重聚合酶链反应检测儿童重症社区获得性肺炎病原，与常规检测方法比较能快速获取结果、灵敏度高，对及时治疗策略的制定具有参考价值。
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肺炎是导致全球5岁以下儿童死亡的主要原因，也是我国小儿死亡的首位病因[1,2]。儿童重症社区获得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)的常见病原体有腺病毒、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、甲型流感病毒和肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)等。快速准确明确病原，尽早采取相应干预对改善患儿预后有重要意义。2012年Pierce等[3]观察到采用"FilmArray"系统进行自动巢式多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测可同时检测多种病原体，具有快速、同时覆盖多种病原、敏感度和特异度高等优点。但至今国内采用快速自动巢式多重PCR检测儿童重症肺炎病原尚未普遍开展。2017年1月至2018年6月上海交通大学附属儿童医院重症医学科(PICU)采用呼吸道测试条(respiratory panel，R-Panel)自动巢式多重PCR检测儿童重症CAP病原，报告如下。
前瞻性收集2017年1月至2018年6月上海交通大学附属儿童医院PICU收治的65例重症CAP患儿，诊断均符合我国《儿童社区获得性肺炎管理指南(2013修订)》儿童重症肺炎诊断标准[4]：(1)一般情况差；(2)拒食或脱水征；(3)意识障碍；(4)呼吸频率明显增快(婴儿RR>70次/min，年长儿RR>50次/min)；(5)紫绀；(6)呼吸困难(呻吟、鼻翼煽动、三凹征)；(7)多肺叶受累或≥2/3的肺；(8)胸腔积液；(9)脉搏血氧饱和度≤0.92；(10)肺外并发症。本研究获患儿家属知情同意，并经医院伦理委员会批准(批号：2018R039-F01)。
65例诊断为重症肺炎的患儿在入PICU 24 h内通过吸痰管吸取患儿深部痰液、留取血液标本行免疫荧光及鼻咽拭子标本行胶体金检测病毒、支原体、衣原体和百日咳菌。同时将深部痰标本采用Filmarray R-Panel进行自动巢式多重PCR检测17种呼吸道病原。
使用Filmarray检测平台(美国BioFire Diagnostics公司)，其提供的R-Panel覆盖腺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、偏肺病毒、人鼻病毒/肠病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒(1型、2型、3型、4型)、RSV、百日咳杆菌、MP、肺炎衣原体。留取患儿痰标本，放入病毒采样管，立即上机检测。
留取患儿痰液和血液，分别使用D3 UltraTM DFA Respiratory Virus Screeing & ID Kit直接免疫荧光检测(DFA)试剂盒(美国Diagnostic Hybrids公司)及9项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒(安图生物工程)进行偏肺病毒、RSV、副流感病毒(1型、2型、3型)、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、嗜肺军团菌、MP、立克次体、肺炎衣原体检测。
留取患儿鼻咽拭子标本，使用胶体金试纸条(韩国Standard Diagnostics公司)检测甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原。
采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计数资料用例数和百分率(%)表示，两组间差异比较采用卡方检验；符合正态分布的计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示，两组间差异比较采用t检验。偏态分布计量资料以中位数(四分位数间距)[M(P25，P75)]表示。P<0.05为差异有统计学意义。
65例重症CAP患儿中男40例，女25例；年龄15(9，36)个月；体重(12.67±7.97)kg；入PICU 24 h内第三代小儿死亡危险评分(pediatric risk of mortalityⅢ，PRISMⅢ)为10(5，17)分；其中合并急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)16例、休克16例、急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)5例、胃肠障碍5例、肝功能障碍5例、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)8例；机械通气治疗时间5(3，10)d；出院存活率为92.31%。
65例重症CAP患儿进行自动巢式多重PCR检测，总阳性率为58.46%(38/65)，12例患儿同时检出2种或2种以上病原体，阳性率为18.46%(12/65)。其中人鼻病毒/肠病毒检出率最高23.08%(15/65)，其次为腺病毒15.38%(10/65)，呼吸道合胞病毒检出率为9.23%(6/65)，副流感病毒3型、肺炎支原体检出率为7.69%(5/65)，甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型检出率为3.08%(2/65)，副流感病毒4型、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、偏肺病毒检出率均为1.54%(1/65)。
R-Panel可在1 h内检测17种病原体，其中冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、人鼻病毒、肠病毒、副流感病毒4型、百日咳杆菌7种病原无法通过常规免疫荧光、胶体金法进行检测。虽然腺病毒、RSV、MP等10种病原在常规方法中有所覆盖，但在本研究中发现R-Panel阳性率高于常规检测方法，其中腺病毒阳性率分别为15.38%和4.62%，差异有统计学意义(P＝0.041)，见表1。
R-Panel与常规方法检测不同病原体阳性率的比较[例(%)]
R-Panel与常规方法检测不同病原体阳性率的比较[例(%)]
| 病原体 | R-Panel | 常规方法 | χ2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 腺病毒 | 10(15.38) | 3(4.62) | 4.188 | 0.041 |
| 呼吸道合胞病毒 | 6(9.23) | 2(3.08) | 2.131 | 0.144 |
| 副流感病毒1型 | 2(3.08) | 0(0) | 2.031 | 0.154 |
| 副流感病毒3型 | 5(7.69) | 4(6.15) | 0.119 | 0.730 |
| 甲型流感病毒 | 2(3.08) | 2(3.08) | <0.001 | 1.000 |
| 乙型流感病毒 | 2(3.08) | 2(3.08) | <0.001 | 1.000 |
| 肺炎支原体 | 5(7.69) | 2(3.08) | 1.359 | 0.244 |
65例重症肺炎患儿使用R-Panel检测腺病毒的灵敏度显著高于常规检测方法(100.00%比30.00%，χ2＝107.692，P<0.001)，特异度低于常规检测方法(88.71%比100.00%，χ2＝11.640，P＝0.001)。追踪这些患儿症状特点、肺部影像学与实验室指标(常规和免疫学指标)、以及病情发展情况，临床符合重症腺病毒感染。R-Panel检测MP的灵敏度显著高于常规检测方法(100.00%比40.00%，χ2＝85.714，P<0.001)，特异度低于常规检测方法(95.24%比100.00%，χ2＝5.128，P＝0.024)；R-Panel检测RSV和副流感病毒3型的灵敏度显著高于常规检测方法(RSV：50.00%比16.67%，χ2＝24.442，P<0.001;副流感病毒3型：100.00%比80.00%，χ2＝22.222，P<0.001)，特异度无显著差异。见表2。
R-Panel与常规方法之间灵敏度及特异度比较
R-Panel与常规方法之间灵敏度及特异度比较
| 病原体 | R-Panel＋，常规＋(例) | R-Panel＋，常规－(例) | R-Panel－，常规＋(例) | R-Panel－，常规－(例) | 灵敏度(%) | 特异度(%) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| R-Panel | 常规 | χ2值 | P值 | R-Panel | 常规 | χ2值 | P值 | |||||
| 腺病毒 | 3 | 7 | 0 | 55 | 100 | 30.00 | 107.692 | <0.001 | 88.71 | 100 | 11.640 | 0.001 |
| 呼吸道合胞病毒 | 1 | 5 | 1 | 58 | 50 | 16.67 | 24.442 | <0.001 | 92.06 | 98.31 | 0.004 | 0.950 |
| 副流感3型 | 4 | 1 | 0 | 60 | 100 | 80.00 | 22.222 | <0.001 | 98.36 | 100 | 2.020 | 0.155 |
| 肺炎支原体 | 2 | 3 | 0 | 60 | 100 | 40.00 | 85.714 | <0.001 | 95.24 | 100 | 5.128 | 0.024 |
注：常规＋，免疫荧光法或胶体金法检测结果为阳性；常规－，免疫荧光法及胶体金法检测结果均为阴性；以常规检测方法作为金标准。
本文探讨R-Panel利用巢式多重PCR技术快速检测儿童重症肺炎患者病原的作用。通过对65例重症CAP患儿痰液R-Panel检测与常规病原学检测方法进行比较，R-Panel在2 h内即可检测17种病原，其腺病毒阳性率显著高于传统检测方法。对腺病毒、RSV、副流感病毒3型、MP的检测灵敏度明显高于常规方法。提示采用R-Panel是一种快速、灵敏度高，对临床检测病原菌具有发展价值的方法。
引起儿童CAP的首位病原体是病毒，近年来我国小儿病毒性肺炎发病率呈进一步增多趋势[5]。重症非典型微生物肺炎可累及肺内和肺外多系统功能障碍[6,7]。通过快速病原检测缩短病原诊断时间，及时给予有效治疗，有可能降低病死率。目前常用的呼吸道病原检测方法有直接免疫荧光法(direct immune-fluorescent antibody，DFA)、病毒分离培养法、免疫胶体金技术等。免疫荧光法检测成本高昂，应用面窄，检测时间一般需6 h；病毒分离培养虽为病原检测金标准，但阳性率低、周期长，对标本采集技术要求高[8]；免疫胶体金法虽操作简便，但灵敏度低。有文献报道自动巢式多重PCR系统灵敏度为95%，特异度高达99%[3,9,10]。本组采用Filmarray R-Panel自动巢式多重PCR对腺病毒、流感病毒、副流感病毒、RSV、百日咳杆菌、MP、肺炎衣原体等17种常见呼吸道感染病原同时进行检测，将核酸提取、扩增及产物检测整合，在2 h内明确病原。Rand等[10]已发现使用R-Panel检测RSV、副流感病毒和偏肺病毒的敏感性明显高于常规方法，而本次研究中65例重症肺炎患儿R-Panel检测腺病毒、副流感病毒3型和MP的灵敏度为100%，显著高于常规方法的灵敏度，提高20%～70%(P<0.001)。对于常规检测方法不敏感的RSV，可将常规检测敏感度的16.67%提高至50%(P<0.001)；虽然R-Panel检测特异度略低于常规方法，但早期敏感识别病原仍具有较高的临床价值。
本组R-Panel自动巢式多重PCR检出率最高为人鼻病毒/肠病毒23.08%(15/65)，但Nokso-Koivisto等[11]发现人鼻病毒/肠病毒是无症状携带者中最常见的病毒；这提示R-Panel的阳性检测结果仍需要结合临床症状和传统检测方法。本组人鼻病毒/肠病毒阳性者是否为重症肺炎病因无法确定。本组观察到腺病毒检测阳性率显著高于传统方法，这些病例临床特征与重症腺病毒感染相符合。腺病毒可引起致命性肺炎，即使在长期ECMO支持下病死率仍高达75%[12]。因此，腺病毒肺炎的早期识别为早期针对性治疗提供了重要依据。
重症肺炎患儿常存在混合感染，Zhang等[13]研究提示病毒混合和合并条件致病菌感染，可能是导致病毒感染肺炎患儿病情加重的重要诱因。国外学者用不同方法检测呼吸道混合感染的阳性率分别为15.9%、10%、8.7%[14,15,16]。本次研究中使用R-Panel在12例患儿中同时检出2种或2种以上病原体，阳性率为18.46%(12/65)。有研究发现自动巢式多重PCR检测阳性的肺炎患者住院时间明显缩短[17]。这可能与R-Panel检测能覆盖更多病原、更早得到感染病原信息，避免反复进一步的诊断测试，根据不同病原体造成重症肺炎的病理生理过程给予针对性治疗，从而阻止CAP的进展并改善预后有关。
应用R-Panel进行巢式多重PCR方法尚未在儿科临床普及应用。本组研究结果观察到自动巢式多重PCR检测法能快速为重症肺炎患儿提供病原诊断，有助于尽早启动相应救治策略。但本组数较少，还需要大样本的临床研究来进一步验证。
所有作者均声明不存在利益冲突
