动态观察不同浓度氧气暴露后新生大鼠肺发育的病理改变，初步探讨不同浓度氧气对新生大鼠肺发育的影响，为基础研究制造支气管肺发育不良模型提供理论依据。
采用随机数字表法将128只足月新生SD大鼠随机分为氧气A组(FiO2>0.9)、氧气B组(FiO2＝0.6)、氧气C组(FiO2＝0.4)和空气组，每组32只。每组分别于实验第3、7、14和21天随机选取8只麻醉后处死收集肺组织。记录吸入高氧后新生大鼠的一般状态、体重变化、肺组织的病理改变、辐射状肺泡计数(radical alveolar count，RAC)、平均肺泡直径(mean alveolar diameter，MAD)及肺泡间隔厚度(alveolar septal thickness，AST)。
与同日龄空气组比较，氧气A组大鼠吸氧3 d后体重明显下降，氧气B组吸氧7 d后体重明显下降，氧气C组各时间点体重较空气组略有下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色可见氧气A组和氧气B组肺泡腔均明显增大，肺泡结构简单化，肺泡间隔不同程度增厚，氧气A组肺泡数目减少更明显，肺泡间隔更厚。氧气C组肺泡改变较氧气B组和氧气A组明显减轻，仍可见少许棘突和次级隔。氧气A组和氧气B组的RAC于生后7 d开始较空气组明显减少(P<0.05)，氧气C组的RAC较空气组略有减少，于第14天开始差异有统计学意义(P<0.05)。氧气A组和氧气B组的MAD和AST于生后7 d开始较空气组明显增高(P<0.05)，氧气C组随日龄增长MAD和AST略有下降，但下降不明显，于生后21 d与空气组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。
不同浓度的氧气均可对肺泡发育产生影响，持续吸入>60%浓度氧气即可出现较严重肺泡发育不良，为研究支气管肺发育不良的发病机制提供模型基础。
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支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早产儿严重的肺部并发症，早产儿吸入高浓度氧气是发生BPD的一个主要因素[1]。动物实验中常用高氧暴露制造BPD动物模型来研究BPD的发病机制，但不同浓度氧气对肺发育的影响也不尽相同。本实验以不同浓度氧气诱导新生大鼠肺组织损伤，初步探讨不同浓度氧气对肺发育和损伤的影响。
足月新生SD大鼠128只，体重5～9 g，雌雄不限，按随机数字表法随机分为氧气A组[吸入氧浓度(FiO2)>0.9]、氧气B组(FiO2＝0.6)、氧气C组(FiO2＝0.4)和空气组，每组32只。氧气A、B、C组将足月新生SD大鼠生后即置于氧箱中，持续输入氧气，维持FiO2分别为>0.9、0.6和0.4，FiO2由测氧仪连续记录(型号572；仕富梅，诺伍德，英国)。用钠石灰吸收CO2，CO2浓度<0.5%，温度为25～27 ℃，湿度50%～70%。每天定时开箱0.5 h，添加水、饲料及更换垫料，并每天与对照组交换代母鼠，以避免因氧中毒而致喂养能力下降。空气组吸入空气，具体方法及控制因素同实验组。
每组大鼠分别于实验第3、7、14和21天随机选取8只麻醉后处死，快速打开胸腔，分离肺组织。将左肺组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，常规制备4 μm切片，切片进行HE染色，脱蜡、水化、染色、封片，于光学显微镜下观察新生大鼠肺组织的形态结构变化。
在光镜下从终末细支气管中心至最近结缔组织隔膜引垂直线，该垂直线上的肺泡数就是RAC值，反映终末呼吸单位所含肺泡数目，为肺发育程度的检测指标[2]。在100×光镜下，每组选取8张切片，每张切片3次计数，取平均值。
在100×光镜下，每组选取8张切片，每张切片选取3个视野，每个视野至少测量10个肺泡，取平均值。
在100×光镜下，每组选取8张切片，每张切片随机选取3个视野，测量每个视野中AST，取平均值。
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，所有数据均以均值±标准差(Mean±SD)表示，各组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
空气组第3天和第7天，新生鼠反应好，吃奶好，体重增加，皮色红润。空气组第14天，新生鼠体毛光泽，睁眼。空气组第21天，新生鼠开始吃鼠粮，饮食好，体毛浓密，有光泽。
与空气组各时间点相比较，氧气A组第3天，新生鼠离氧后呼吸稍快、无呼吸困难及发绀，第7天新生鼠皮色苍白，口周略发绀，反应尚可，离氧后呼吸稍快、无呼吸困难，第14天新生鼠反应差，不活泼，体毛稀疏，无光泽，时有头颤，离氧后呼吸增快，出现呼吸困难，口周发绀，头颤明显。恢复氧供后可缓解，第21天新生鼠反应极差，身长、体重明显下降，明显呼吸困难和发绀，头颤明显，出现对高氧的依赖，离氧后呼吸困难、发绀加重。氧气B组第3天新生鼠离氧后呼吸无明显增快，无呼吸困难及发绀，第7天新生鼠皮色略苍白，口周无发绀，反应良，离氧后呼吸稍快，无呼吸困难，第14天新生鼠反应一般，不活泼，体毛涩，无光泽，无头颤，离氧后呼吸增快，出现呼吸困难、口周发绀、头颤。第21天新生鼠反应差，身长、体重下降，有头颤，离氧后出现呼吸困难和发绀。氧气C组第3天新生鼠反应良，呼吸平稳，体重有所增长，离氧后呼吸无增快，第7天新生鼠皮色稍红润，口周略发绀，反应尚可，离氧后呼吸稍快，无呼吸困难，第14天新生鼠反应可，体毛光泽差，无头颤，离氧后呼吸稍增快，无呼吸困难和发绀，第21天新生鼠反应稍差，无头颤，离氧后无呼吸困难和发绀，对氧气基本没有依赖。
与同日龄空气组比较，氧气A组3、7、14、21 d体重增加明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，氧气B组7、14、21 d体重增加明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，氧气C组各时间点体重较空气组略有下降，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
新生大鼠生后不同时间点空气组与氧气组体重比较(Mean±SD，g)
新生大鼠生后不同时间点空气组与氧气组体重比较(Mean±SD，g)
| 组别 | 鼠数(只) | 3 d | 7 d | 14 d | 21 d |
|---|---|---|---|---|---|
| 氧气A组 | 8 | 9.50±1.00a | 13.00±1.38a | 20.50±0.45a | 25.50±0.89a |
| 氧气B组 | 8 | 11.00±0.54 | 17.50±1.79a | 31.00±0.71a | 43.00±1.67a |
| 氧气C组 | 8 | 12.00±1.92 | 20.50±1.00 | 36.50±1.00 | 51.00±0.89 |
| 空气组 | 8 | 12.00±1.45 | 21.50±0.63 | 38.00±1.41 | 52.50±1.00 |
| F值 | 4.72 | 53.77 | 407.57 | 658.52 | |
| P值 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
注：与同时间点空气组比较，aP<0.05。
空气组第3天，肺泡间隔较薄，肺泡数目较少，肺泡大小均匀，与空气组第3天相比，空气组第7天，肺泡间隔变薄，肺泡大小均匀，空气组第14天和21天，肺泡数目增多，肺泡腔均匀，肺间隔棘突出现，肺间隔较薄，次级间隔数量明显增多。
与同日龄空气组相比，氧气A组、氧气B组和氧气C组第3天均可见肺泡间隔变厚。氧气A组、氧气B组和氧气C组第7天均可见肺泡数量变少，体积变大，形态不规则，肺泡间隔略厚，肺泡腔内可见炎性细胞浸润。在第14天，氧气A组肺泡腔明显增大，肺泡数目明显减少，肺间隔厚，肺泡结构简单化。氧气B组肺泡腔明显增大，肺泡数目减少，肺间隔较厚，肺泡结构简单化。氧气C组肺泡腔稍增大，肺泡数目略减少，肺间隔增厚不明显，可见少许棘突和次级隔。在第21天，氧气A组和氧气B组肺泡腔均明显增大，肺泡结构简单化。氧气A组肺泡数目减少更明显，肺间隔更厚。氧气C组肺泡腔增大，肺泡数目减少，肺间隔略增厚，可见少许棘突和次级隔，见图1。
氧气A组和氧气B组随时间延长肺泡腔明显增大，肺泡结构简单化，肺泡间隔不同程度增厚，氧气A组肺泡数目减少更明显，肺泡间隔更厚。氧气C组肺泡改变较轻，第21天仍可见少许棘突和次级隔。
空气组新生大鼠RAC随日龄呈增加趋势。与同日龄空气组比较，氧气A组从第7天开始下降，并持续至21 d(P<0.05)。氧气B组随日龄增长，RAC逐渐升高，但升高不明显，生后第7、14天和21天差别不大，与各时间点空气组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。氧气C组随日龄增长，RAC逐渐升高，并且升高明显，生后第3天和第7天与同日龄空气组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，在生后第14天和第21天与空气组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
不同时间点空气组与氧气组肺组织RAC比较(Mean±SD，个)
不同时间点空气组与氧气组肺组织RAC比较(Mean±SD，个)
| 组别 | 鼠数(只) | 3 d | 7 d | 14 d | 21 d |
|---|---|---|---|---|---|
| 氧气A组 | 8 | 6.25±0.04 | 6.37±0.07a | 5.17±0.14a | 4.57±0.18a |
| 氧气B组 | 8 | 6.26±0.03 | 6.61±0.04a | 6.73±0.14a | 7.11±0.30a |
| 氧气C组 | 8 | 6.37±0.14 | 7.02±0.11 | 9.13±0.08a | 9.47±0.26a |
| 空气组 | 8 | 6.39±0.10 | 7.12±0.06 | 9.64±0.26 | 9.93±0.13 |
| F值 | 4.20 | 134.21 | 961.71 | 682.22 | |
| P值 | >0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
注：与同时间点空气组比较，aP<0.05；RAC：辐射状肺泡计数。
空气组新生大鼠MAD和AST随日龄逐渐下降。与空气组比较，氧气A组从第7天开始逐渐增加，较同时间点空气组明显增加(P<0.01)。氧气B组随日龄增长MAD和AST均逐渐增高，氧气B组MAD从第7天开始增加，较同时间点空气组明显增加(P<0.01)；氧气B组AST在生后第7天增高不明显，但与对应空气组相比差异有统计学意义(P<0.05)，第14天和21天与对应空气组相比，增高明显，差异有统计学意义(P<0.01)。氧气C组随日龄增长MAD和AST略有下降，但下降不明显，第3天、7天和14天与各时间点空气组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，第21天与空气组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3、表4。
不同时间点空气组与氧气组肺组织MAD比较(Mean±SD，μm)
不同时间点空气组与氧气组肺组织MAD比较(Mean±SD，μm)
| 组别 | 鼠数(只) | 3 d | 7 d | 14 d | 21 d |
|---|---|---|---|---|---|
| 氧气A组 | 8 | 59.87±3.48 | 72.15±4.05a | 75.20±4.36a | 81.50±5.13a |
| 氧气B组 | 8 | 58.57±3.20 | 55.92±3.87a | 73.92±4.20a | 79.79±3.72a |
| 氧气C组 | 8 | 57.30±4.37 | 46.22±6.03 | 37.75±5.87 | 77.03±4.23b |
| 空气组 | 8 | 56.27±3.11 | 43.83±4.11 | 31.90±2.93 | 28.25±5.38 |
| F值 | 1.13 | 46.93 | 160.11 | 181.95 | |
| P值 | >0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
注：与同时间点空气组比较，aP<0.01,bP<0.05；MAD：平均肺泡直径。
不同时间点空气组与氧气组肺组织AST比较(Mean±SD，μm)
不同时间点空气组与氧气组肺组织AST比较(Mean±SD，μm)
| 组别 | 鼠数(只) | 3 d | 7 d | 14 d | 21 d |
|---|---|---|---|---|---|
| 氧气A组 | 8 | 6.92±0.19 | 7.38±0.31a | 13.63±0.76a | 15.76±0.50a |
| 氧气B组 | 8 | 6.77±0.45 | 6.98±0.44b | 9.72±0.57a | 10.10±0.47a |
| 氧气C组 | 8 | 6.78±0.33 | 6.40±0.51 | 6.10±0.34 | 5.27±0.46b |
| 空气组 | 8 | 6.72±0.68 | 6.23±0.47 | 5.20±0.28 | 4.32±0.57 |
| F值 | 0.22 | 8.87 | 326.65 | 632.15 | |
| P值 | >0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
注：与同时间点空气组比较，aP<0.01,bP<0.05；AST：肺泡间隔厚度。
BPD是早产儿，尤其是小早产儿常见的慢性肺部疾病[3]。Northway等[4]在1967年首次提出BPD的概念。近年来由于围产医学的迅速发展，临床上更为常见的是一种轻型BPD，主要病理表现为肺泡结构简单化和肺微血管发育停止[5,6,7]。导致BPD发生的因素复杂多样，为探索BPD的发病机制及其防治措施，需要应用可靠的动物模型来研究。高氧诱导的BPD模型是众多动物模型中最常见和最主要的模型，并且高氧是导致早产儿急性肺损伤的重要因素[8]。很多学者使用高氧诱导的BPD动物模型进行疾病的研究[9,10,11]，目前缺乏关于不同浓度氧气所致肺损伤的系统归纳和总结。本实验将足月新生SD大鼠生后置于3种不同浓度氧下，制造新生大鼠肺组织损伤模型，观察不同浓度氧对新生大鼠肺发育和损伤的影响。
发育生物学已证实人类的肺发育大致分为胚胎期(0～6周)，假腺体期(6～15周)，微管期(15～23周)，囊泡期(23～36周)和肺泡期(36周～2岁)。大鼠生后1 d的肺组织正处于囊泡期，而大多数发生BPD的早产儿出生于肺发育阶段的囊泡期，因此应用生后1 d的足月新生大鼠制造BPD模型，可以模拟人类早产儿肺损伤的病理变化。新近的研究显示，无论吸入哪种浓度的氧气均可以对肺发育产生明显影响，当吸入氧气浓度为85%时，肺组织同时出现肺泡数量减少和肺泡间隔变厚这2个经典BPD的肺组织病理学特征。当氧气浓度下降至60%或40%时，肺组织只出现肺泡数量下降，而AST改变很小[12]。本研究结果显示，氧气浓度为90%时，肺组织逐渐出现肺泡腔扩大，肺泡数量减少，局限性肺气肿，肺间质成纤维细胞增多，肺间隔明显增厚，肺部病理学改变以肺间质纤维化和肺气肿为主。氧气浓度60%时肺组织逐渐出现肺泡腔扩大，肺泡数量减少，正常肺泡结构消失，肺泡结构简单化，而肺间隔增厚不明显，肺部病理改变主要表现为肺泡发育障碍，而肺间质纤维化表现较轻。氧气浓度40%时肺组织肺泡腔扩大不明显，肺泡数量略减少，结构稍简单，但仍可见少量棘突和次级隔。空气组显示肺泡体积变小，大小均匀，数量增多，可见较多棘突和次级隔。Buczynski等[13]在新生小鼠中观察了不同梯度的氧浓度(分别为21%～100%)暴露对肺泡发育的影响；Nardiello等[14]总结了不同浓度氧(40%～100%)暴露下肺组织的病理特点，本研究结果与国外报道基本一致。
肺发育成熟的重要特点是由体积大、数量少的囊泡向体积小、数量多的肺泡转化。RAC是反映肺泡化程度的重要指标，用以代表肺泡的大小[15]。本研究结果显示，空气组新生大鼠RAC值随生后日龄逐渐增加，90%浓度氧组从7 d开始持续下降，60%浓度氧组随时间延长RAC略有升高，与各时间点空气组相比差异有统计学意义，40%浓度氧组随时间延长RAC逐渐升高，组间差异有统计学意义，在生后第14天和第21天与空气组差异有统计学意义。以上结果提示3种浓度的氧均可以影响肺泡形态，随着氧浓度的增高，肺组织肺泡化程度更低，肺间隔更厚，损害更严重。3种浓度氧均可使肺泡化程度降低，肺组织从囊泡期向肺泡期的发育受阻，不同程度导致肺泡结构简单化。
MAD和AST也是反映肺发育程度的重要指标。有学者从实验技术角度分析认为，肺组织经过石蜡包埋、脱蜡和脱水等一系列操作后测得的AST可能并不能真实反映肺泡的发育情况[16]。由于处理的一致性，很多学者还是应用AST来评价肺泡发育的程度[12]。本研究结果显示空气组新生大鼠MAD和AST随日龄逐渐下降。90%浓度氧组和60%浓度氧组MAD和AST从第7天开始逐渐增加，但是90%浓度氧组增加的更明显。40%浓度氧组随时间延长MAD和AST略有下降，但下降不明显。由此可见90%浓度氧对新生大鼠MAD和AST的影响更大，尤其是对AST的影响，这也说明90%浓度氧暴露更易使肺组织出现肺间质纤维化和肺气肿的病理学改变，60%浓度氧暴露更易使肺组织出现肺泡发育障碍的病理学改变。
不同浓度氧暴露下，新生鼠肺组织发育受到不同程度的阻滞，肺泡气体交换面积不同程度减少，影响肺组织的气体交换过程，出现不同程度的生长受限。本研究结果显示，与空气组各个时间点相比，90%浓度氧组从生后3 d开始体重明显下降，出现生长受限，60%浓度氧组从生后7 d开始出现生长受限，40%浓度组较空气组体重略有下降，但差异无统计学意义。由此可见，吸入的氧气浓度越高，时间越长，新生鼠的生长受限越严重，对新生鼠的危害越大。
综上所述，不同浓度的氧气均可对肺泡发育产生影响，吸入氧浓度越高，对肺组织损伤越重，持续吸入>60%浓度氧气可致新生大鼠生长迟缓和肺损伤，为BPD的发病机制研究提供实验基础。
所有作者均声明不存在利益冲突
