研究长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(taurine upregulation gene 1，Tug1)在新生大鼠支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)模型中的表达，并从肺组织形态学及肺泡发育成熟度两方面探究长链非编码RNA Tug1与肺发育的相关性，为阐明BPD中肺发育障碍的病理机制奠定基础。
采用高氧诱导新生SD大鼠制备BPD模型(氧浓度为85%，n＝40)，对照组为空气环境正常生长的新生SD大鼠(氧浓度21%，n＝40)。每组分别于生后1、3、7、14 d随机取10只采集肺组织样本。通过苏木精-伊红染色观察肺组织形态学改变，应用辐射状肺泡计数法(RAC)评估肺泡发育成熟度，利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肺组织中长链非编码RNA Tug1及血小板源性生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor alpha，Pdgfra)的基因水平，用蛋白免疫印迹技术检测Pdgfra的蛋白表达情况。
在对照组，Tug1及Pdgfra的mRNA表达随日龄增加呈递增趋势，且Tug1的表达与RAC值呈显著正相关(r＝0.648，P＝0.007)，与Pdgfra的mRNA表达呈正相关(r＝0.572，P＝0.021)，与Pdgfra蛋白表达也呈正相关(r＝0.755，P＝0.001)。模型组中，Tug1表达从7 d开始显著低于对照组(0.78±0.20比1.68±0.20，P＝0.04)，趋势持续至14 d；Pdgfra的mRNA表达从7 d开始显著低于对照组(1.04±0.25比1.62±0.37，P＝0.002)，趋势持续至14 d。Pdgfra蛋白表达在对照组随日龄增加呈递增趋势，模型组7 d开始显著低于对照组(1.04±0.13比1.62±0.09，P＝0.04)，趋势持续至14 d。
长链非编码RNA Tug1与肺发育成熟度密切相关，其表达在正常发育肺组织中呈递增趋势，新生大鼠BPD模型肺组织中Tug1表达下调可能是BPD肺泡发育障碍的发生机制之一。
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支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早产儿常见的并发症之一。随着围产医学的迅速发展，呼吸支持策略的不断优化，肺表面活性物质的及时应用，极低和超低出生体重儿存活率逐渐升高，而BPD发病率也逐年上升。其遗留的短期或长期不良结局不仅影响患儿生命及生活质量，还给患儿家庭乃至整个社会带来沉重的经济负担[1]。
新型BPD的发生与肺发育不成熟有密切关系，胎龄小，出生体重低的早产儿更易患BPD[2]。胚胎肺发育分为5个时期，其中肺泡期为肺泡发育成熟的关键时期，大多数早产儿出生时肺发育处于囊泡期，肺部解剖结构及生理功能尚不成熟，极易受高氧、机械通气压力等因素影响，使肺泡发育进程受阻，表现为肺发育停滞、肺泡简单化和肺小血管发育不良。大量研究证实血小板源性生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor alpha，Pdgfra)是肺泡发育成熟度的标志，与肺发育不良密切相关，对Pdgfra(＋)细胞进行遗传消融可使肺泡简单化[3,4]。近年来长链非编码RNA在多领域成为研究热点，其中长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(taurine upregulation gene 1，Tug1)是一个与发育相关的指标，已被证实在大脑皮质、神经元及视网膜发育中扮演重要角色[5,6,7]。但是Tug1在发育中的肺组织及BPD中的表达还尚未见相关报道。本研究旨在阐明Tug1及Pdgfra在发育期肺组织及BPD动物模型中的表达情况，从肺组织形态学及肺泡发育成熟度方面探讨Tug1与肺发育的相关性。
SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠20只(雌性16只，雄性4只，体重220～250 g)，生产于北京华阜康生物科技股份有限公司。本研究所涉及的动物实验均经中国医科大学动物实验伦理委员会审批同意，外科手术均在戊巴比妥钠麻醉后实施。于母鼠自然分娩后12 h内将新生大鼠随机分为对照组(n＝40)和模型组(n＝40)。
一抗anti-PDGFRA(沈阳Wanleibio科技有限公司)，anti-β-actin(美国Proteintech生物公司)，BCA蛋白质浓度测定试剂盒(Beyotime生物技术有限公司)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(Beyotime生物技术有限公司)，TUG1及PDGFRA引物(上海生工生物工程股份有限公司)。反转录试剂盒RR047A及PCR试剂盒RR820(Takara)。
模型组于生后12 h内放入氧箱，氧箱内FiO2 0.85，CO2<0.5%，湿度60%～70%，温度21～25 ℃。对照组以相同的护理条件置于空气环境饲养(FiO2 0.21)。每天定时交换模型组与对照组母鼠，每组分别于生后1、3、7及14 d随机选取10只幼鼠采集肺组织[8]。
在生后1、3、7、14 d分别从模型组和对照组随机抽取10只幼鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.06 mL/g)麻醉后，剪开左心耳，从右心室刺入头皮针，将PBS缓慢持续注入肺循环系统直至无色透明液体从左心耳流出。用4%多聚甲醛固定右肺下叶用于制备石蜡切片，其余肺组织迅速放入液氮转移至-80 ℃保存，用于RT-PCR及Wesstern blot等实验。
将3 μm石蜡切片脱蜡后进行HE染色，在光学显微镜下观察。每组于4个时间点分别选取8张组织切片用于组织形态学分析。从呼吸性细支气管中心至最近纤维隔(或胸膜)引一条垂线，该垂线上的肺泡个数即为RAC值[9]。
随机选取冻存肺组织，提取总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，用TB-Green试剂盒及引物，采用20 μL体系进行定量PCR扩增，见表1。
实时荧光定量PCR引物
实时荧光定量PCR引物
| 基因名称 | 正向引物(5′→3′) | 反向引物(5′→3′) |
|---|---|---|
| Tug1 | GGCGTATAGAAGGTTGGCAGCAG | ACTTGGCAAGCAGGTCTGTGATG |
| Pdgfra | GTGCCGCTGAGTTCGTCCTTC | GCTGAGGCGTTGACCACTTCC |
| β-actin | TGTCACCAACTGGGACGATA | GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA |
随机选取冻存肺组织提取蛋白，并测蛋白浓度。按比例上样后进行凝胶电泳、转膜，封闭，TBST清洗后，加入一抗4 ℃摇床过夜。次日回收一抗，TBST清洗，加入二抗室温孵育2 h，TBST洗净后化学发光法显色，用灰度值表示结果。
应用SPSS 20.0和Graphpad Prism7.0软件进行统计学分析及作图，计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，采用皮尔逊相关系数法进行相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。
正常肺组织生后1 d形态表现为肺泡数目少、间隔较厚，肺组织形态结构不规则；随发育时间延长，肺泡数目越来越多，肺泡间隔越变越薄且数目增多，肺组织结构和肺泡形态大小逐渐变得有规律。与对照组相比，模型组3 d肺泡间隔稍厚；7 d肺泡数目少，肺泡间隔变厚，血管充血，间质水肿；14 d肺泡间隔数目减少，肺泡体积增大，肺泡融合且数目减少，形态不规则。
A-D：对照组1 d、3 d、7 d、14 d；E-H：模型组1 d、3 d、7 d、14 d。
正常肺组织随发育时间延长，RAC值逐渐升高，7 d和14 d较1 d均显著增加(P<0.01)，提示对照组肺发育逐渐成熟。与对照组相比，模型组1 d及3 d RAC值差异无统计学意义；7 d和14 d RAC值显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，提示模型组肺发育阻滞，见图2。
与对照组比较，aP<0.05;与同组1 d比较，bP<0.05。
对照组中Tug1的表达量在1、3、7、14 d呈递增趋势，7、14 d较第1天显著增加(P<0.05)；与对照组相比，7、14 d BPD组Tug1的表达量显著降低(P<0.05)；对照组中Pdgfra的mRNA表达量随时间呈递增趋势，7 d和14 d显著高于1 d(P<0.05)；与对照组相比，模型组从3 d开始显著低于对照组，趋势保持至14 d(P<0.05)，见图3。
A．Tug1的组织表达；B．Pdgfra的mRNA组织表达；与对照组比较，aP<0.05；与同组1 d比较，bP<0.05; Tug1：长链非编码RNA牛磺酸上调基因1；Pdgfra：血小板源性生长因子受体α。
对照组Pdgfra的蛋白表达量随发育时间的延长呈递增趋势，7、14 d较第1天显著增加(P<0.05)；与对照组相比，7 d和14 d模型组中Pdgfra的蛋白表达量显著降低(P<0.05)，见图4。
与对照组比较，aP<0.05;与同组1 d比较，bP<0.05；Pdgfra：血小板源性生长因子受体α。
Tug1的表达量与RAC值及Pdgfra mRNA和蛋白表达量呈显著正相关，见图5。
A．对照组中Tug1的表达与RAC值呈显著正相关；B.对照组中Tug1的表达与Pdgfra的mRNA表达呈显著正相关；C.对照组中Tug1的表达与Pdgfra的蛋白表达呈显著正相关；RAC：辐射状肺泡计数；Tug1：长链非编码RNA牛磺酸上调基因1；Pdgfra：血小板源性生长因子受体α。
目前，经典的BPD已很少见，大多数是以肺泡发育障碍和微血管结构紊乱为主要病理改变的新型BPD[10]。胚胎肺发育是一个非常复杂而重要的过程，主要分为5个时期：胚胎期(胎龄3～7周)、腺体期(胎龄5～17周)、小管期(胎龄16～26周)、囊泡期(胎龄24～38周)和肺泡期(胎龄36周至生后3岁)。大鼠肺发育囊泡期为胎龄21 d至生后3 d，肺泡期为生后4～21 d[11]。新生大鼠肺发育相当于胎龄28周人肺发育情况，因其肺分化的时序性与人相似，故对生后12 h内的新生大鼠进行高氧诱导制造BPD模型，能够很好模拟处于囊泡期的早产儿BPD的发生。处于囊泡期的肺组织气道扩张但肺实质发育不成熟，受高氧、机械通气时压力等因素的影响[12]，将导致肺泡发育进程受阻，肺泡简单化、肺泡数目减少、正常肺结构消失、肺泡融合、肺泡间隔增厚，间质纤维化、肺血管生成紊乱等病理学改变，即囊泡期向肺泡期过渡障碍[13]。肺泡形成是肺成熟的最后一步，将肺囊泡区细分为更小的肺泡，新生的间隔极大增加了气体交换表面积，而肺泡发育障碍将导致终身呼吸不足[14]。
为使肺发育有序进行，各种多肽类生长因子之间相互作用，彼此协调，调控不同细胞的增殖、分化和凋亡。这些生长因子的分布和表达具有精确的时序性，任何干预其正常表达的因素都将对肺组织的发育产生深远影响。血小板衍生生长因子(PDGF)家族由四种配体(PDGF-A、B、C、D)组成，通过两个酪氨酸激酶受体(PDGFR-α、-β)发挥作用[15]。Pdgfra基因敲除小鼠在妊娠中期死亡，其多种组织间质发育失败[16]。胚胎发育后期，肺间质Pdgfra的条件失活将导致肺泡简化，提示其在中隔嵴的形成过程中至关重要[17]。Pdgfra可作为肺泡发育成熟度的标志，在成人肺中，Pdgfra(＋)细胞被认为与肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)非常接近，并支持AECⅡ的增殖和分化[18]。在肺泡形成过程中，肌成纤维细胞中表达的Pdgfra可参与肺泡的正常和异常形成，在患有BPD的新生儿间质细胞中发现Pdgfra表达水平降低[3]。本研究对照组模型中，Pdgfra在肺组织中的表达随肺发育时间延长逐渐增加；在BPD模型中Pdgfra的表达从7 d开始显著低于对照组。
长链非编码RNA是指转录本长度>200 nt，不能编码蛋白质的一类RNA分子，可在表观遗传学、转录及转录后3个水平调控基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等生命过程[19,20]。有研究证实lncRNA可在空间上与转录因子相互作用进而调控肺的发育进程，并影响BPD的发生发展[21]。lncRNA Tug1是一种广泛分布于人体各组织中长约7.1 kb，定位于人类染色体22q12.2的lncRNA[7]。Tug1广泛存在于新生小鼠的视网膜及大脑皮质中，敲除Tug1会使小鼠视网膜前体细胞分化障碍，终末分化的视锥细胞和视杆细胞比例也会发生变化[22]。本研究发现，Tug1的表达在正常肺组织中随发育进程呈递增趋势，且分别与肺泡发育成熟度指标Pdgfra及形态学标准RAC值呈显著正相关。而在BPD模型中，从7 d开始Tug1的表达显著低于对照组，这与Pdgfra的表达及RAC值的趋势是一致的。因此本研究从肺组织形态学及肺泡发育成熟度标志物两方面证实了Tug1与肺发育密切相关。
本研究首次在新生大鼠肺发育及BPD模型中检测Tug1的表达情况，从肺组织形态学及肺泡发育成熟度标志物两方面阐述了Tug1与肺发育的相关性，及其可能是BPD中肺泡发育障碍的原因之一。但Tug1在肺发育过程中的具体作用机制及其与Pdgfra之间是否具有相互作用仍需要进一步探索，为BPD肺发育障碍的发病机制研究奠定基础。
所有作者均声明不存在利益冲突
