探讨巨噬细胞极化在新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)发病过程中的作用。
选用SPF级C57BL/6小鼠建立NEC小鼠模型，将早产小鼠随机分为对照组(n＝10)和NEC组(n＝19)。对照组小鼠由母鼠母乳喂养，NEC组小鼠给予缺氧、冷刺激、高渗喂养和脂多糖处理。小鼠出生后96 h收集十二指肠下端至结肠部肠道组织。HE染色观察肠道组织形态；FD70灌胃检测肠道屏障功能；免疫荧光检测肠上皮Pan-keratin表达；原位末端转移酶标记(TUNEL)染色检测肠道上皮细胞凋亡；Western blot检测巨噬细胞极化相关指标CD86和CD206的蛋白表达水平；流式细胞术检测肠道M1型、M2型巨噬细胞比例；RT-PCR检测细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10、IL-12的mRNA表达水平。
与对照组相比，NEC组小鼠存活率显著降低(100.0%比36.8%)，肠道组织出现不同等级损伤，肠上皮完整性遭到破坏，肠上皮细胞凋亡增多(1.9%±1.1%比7.6%±2.6%，P<0.05)，肠道通透性增加(1.53±0.80比14.32±1.27，P<0.05)。Western blot结果显示NEC组CD86蛋白表达上升(1.0±0.01比1.5±0.10，P<0.05)，CD206蛋白表达下降(1.0±0.01比0.6±0.05，P<0.05)；流式细胞学结果显示NEC组CD68+CD86+M1型巨噬细胞比例增加(1.90%±0.19%比10.20%±0.38%，P<0.05)，CD68+CD206+M2型巨噬细胞比例减少(5.8%±0.33%比3.7%±0.56%，P<0.05)，促炎因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、IL-6、IL-12的mRNA(分别为1.00±0.05比1.80±0.17，1.00±0.13比2.00±0.58，和1.00±0.05比1.40±0.22，P<0.05)表达水平明显上升，抗炎因子IL-10的mRNA(1.00±0.22比0.00±0.01，P<0.05)表达水平明显下降。
巨噬细胞向促炎型M1型极化在NEC的发病过程中起重要作用。
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新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是早产儿中常见的严重肠道炎性疾病。NEC起病隐匿，进展迅速，临床表现多样，可出现发热、呕吐、腹胀、肠鸣音减弱或消失、血便等症状。部分患儿经内科治疗后可好转，但部分患儿迅速进展为肠穿孔并引发感染甚至休克[1,2]，且存活患儿也可能并发多系统功能异常，需要长期治疗，由此给患儿家庭及社会带来沉重负担。NEC作为一种临床危重疾病，其高发病率、高病死率及病程进展快等特点已成为临床难题及研究热点，但发病机制至今尚不明确，目前普遍认为其是多因素作用的结果，如早产、低体重、肠道发育不完全、菌群失调、喂养不当和炎症反应等[3,4,5]。
肠道作为人体的消化器官，不仅提供了营养吸收的场所，更在抵御病原体入侵，维持体内免疫稳态方面发挥重要作用[6,7]。巨噬细胞是人体造血系统中可塑性最强的细胞，广泛分布于机体内，并参与机体内生长发育、稳态维持、组织修复、免疫抵抗等一系列活动[8]。在局部微环境因子的刺激下，巨噬细胞可极化为促炎型的M1型或抗炎型的M2型，且极化具有可逆性[8]。既往研究表明，M1和M2型巨噬细胞比例失衡会导致组织损伤和慢性炎症，并引起一系列疾病[9]。本实验拟采用小鼠建模的方式，探究巨噬细胞极化在NEC发生发展过程中的作用，为NEC发病机制的进一步探讨提供理论依据。
实验用成年SPF级C57BL/6小鼠购自北京大学医学部实验动物中心(动物合格证号：11804700003276)。雅培婴儿配方奶粉60/40购自Ross Pediatrics公司(美国)，赐美乐奶粉购自Pet-Ag公司(美国)，FITC-Dextran 70Da(FD70)购自Sigma-Aldrich Inc(美国)，TUNEL凋亡检测试剂盒购自Chemicon International公司(加拿大)，大鼠抗小鼠CD68、兔抗小鼠CD206抗体购自Abcam公司(英国)，小鼠抗Pan-Keratin和兔抗CD86抗体购自Cell Signaling Technology公司(美国)，PCR逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix购自Invitrogen公司(美国)，PCR引物购自武汉擎科公司(中国)，BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物公司(中国)。本研究经华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会审批(批号：[2019]伦审字(S1191号))。
采用文献已发表的早产、缺氧、冷刺激、高渗喂养、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)方法构建小鼠NEC模型[10]。其中，对照组10只，NEC组19只。
每只小鼠取十二指肠、空肠、回肠、结肠各三段，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚切片，HE染色，镜下观察肠道组织学结构，并进行病理损伤程度分级。
小鼠出生后48 h，使用FITC-Dextran 70Da(FD70)给所有存活小鼠进行灌胃，4 h后采集血液，用荧光光谱法测定血浆FD70的水平，根据已知葡聚糖浓度的标准稀释曲线计算血浆中FD70的含量。
小肠石蜡切片给予抗原修复；50 mL/L山羊血清室温下封闭1 h；弃去多余封闭液，滴加小鼠抗Pan-Keratin(1∶100)，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤后，滴加1∶500稀释的Cy3标记的山羊抗小鼠二抗，室温避光孵育1 h；PBS冲洗后封片；荧光显微镜下拍照。
参照试剂盒说明，将小鼠小肠组织切片进行抗原修复并置于TUNEL反应混合液中，37 ℃湿盒避光孵育1 h，PBS浸洗并用含有DAPI的封片剂封片。每只小鼠随机选取3张切片，每张切片随机选择5个高倍视野(400倍)荧光显微镜下进行TUNEL阳性细胞计数，并计算肠道上皮细胞凋亡率(TUNEL阳性细胞占总细胞数的百分比)。
取适量冰冻小鼠小肠组织，处理后进行凝胶电泳并转移至PVDF膜上。使用含5%脱脂牛奶的TBST溶液室温下孵育2 h。加入一抗，兔抗小鼠CD86、大鼠抗小鼠CD206，4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液清洗3次后加入二抗，室温下孵育1 h。使用ECL化学发光检测试剂盒检测蛋白印迹，β-actin作为内参，使用Image J软件将目的蛋白灰度值与内参对比，使用统计软件进行结果分析。
参考Lu等[11]的方法筛选和分离巨噬细胞。取适量小鼠小肠组织，经消化、过滤和离心后制成单细胞悬液，将细胞与流式抗体共孵育30 min后，加入PBS重悬并上流式细胞仪上检测。依据巨噬细胞的表面标记物CD68、CD86、CD206分型巨噬细胞，标记为CD68+CD86+为M1型巨噬细胞，CD68+CD206+为M2型巨噬细胞。
用Trizol试剂提取肠道组织总RNA。使用SuperScript First-Strand cDNA Synthesis system cDNA合成系统进行逆转录cDNA的合成，使用SYBR Green PCR Master Mix进行实时定量PCR。使用GAPDH对样本RNA含量进行标准化分析，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10、IL-12和GAPDH的引物序列详见表1。
PCR引物
PCR引物
| 基因名称 | 引物 | |
|---|---|---|
| 上游 | 下游 | |
| GM-CSF | GGCCTTGGAAGCATGTAGAGG | GGAGAACTCGTTAGAGACGACTT |
| IL-6 | CTGCAAGAGACTTCCATCCAG | AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG |
| IL-10 | CTTACTGACTGGCATGAGGATCA | GCAGCTCTAGGAGCATGTGG |
| IL-12 | GTCCTCAGAAGCTAACCATCTCC | CCAGAGCCTATGACTCCATGTC |
| GAPDH | AGTGCCAGCCTCGTCTCATA | GGTAACCAGGCGTCCGATAC |
注：GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；IL：白细胞介素；GAPDH：内参基因。
采用SPSS 22.0统计软件对实验结果进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差(Mean±SD)表示，对于方差齐性的资料采用两独立样本t检验，方差不齐时采用t′检验，P<0.05为差异有统计学意义。
采用早产、缺氧、冷刺激、高渗喂养、LPS方法构建小鼠NEC模型过程中，对照组小鼠96 h内无死亡，NEC组小鼠在建模24 h、48 h和72 h分别出现5只、4只和3只死亡，最终存活7只，96 h存活率为36.8%，较对照组明显下降，见图1。实验建模过程中，对照组小鼠生长发育良好，活动正常，对外界刺激反应好，大便无异常；NEC组小鼠出现精神差、嗜睡、痉挛、抽搐、腹部膨隆和血便，并随时间延长，逐渐表现出对外界刺激反应欠佳甚至无反应。
NEC：坏死性小肠结肠炎
HE染色组织学观察可见，对照组小鼠肠道结构正常，肠绒毛排列整齐，完整无破坏；NEC组小鼠肠道绒毛出现不同程度的变性水肿、断裂或脱落坏死、肠壁充血、肠道肌层受损变薄等结构损伤。采用既往已发表的方法[10]将小鼠肠道组织损伤程度进行如下评分：0分，正常无损伤(图2A)；1分，上皮细胞有轻微漂浮或分离(图2B)；2分，上皮细胞脱落至绒毛中部水平(图2C)；3分，全绒毛坏死(图2D)；4分，肠道出现穿透性坏死(图2E)。组织损伤评分达到2分及以上者判定为发生NEC。依据上述方法，对照组与NEC组小鼠肠道组织损伤程度评分结果见图3，可见对照组小鼠肠道未出现损伤，NEC组小鼠在建模过程中肠道出现不同程度损伤，NEC发生率达57.9%。
A．0分，正常无损伤；B.1分，上皮细胞有轻微漂浮或分离；C.2分，上皮细胞脱落至绒毛中部水平；D.3分，全绒毛坏死；E.4分，肠道出现穿透性坏死。
黑色圆点数量代表小鼠数量，组织学评分在2分及以上者判定为NEC；NEC：坏死性小肠结肠炎。
TUNEL染色结果显示(图4)，对照组小鼠肠道上皮细胞的凋亡比例为(1.9±1.1)%，NEC组为(7.6±2.6)%，差异有统计学意义(P<0.05)。细胞角蛋白Pan-Keratin免疫荧光组织化学结果显示(图5)，对照组小鼠Pan-Keratin蛋白主要在肠黏膜上皮连续分布，染色排列紧密，边缘光滑，染色较深，肠黏膜上皮完整连续(图5A)；NEC组小鼠荧光表达分布不均匀，有中断现象，肠道上皮完整性明显受损(图5B，箭头所示)。且与对照组相比，NEC组小鼠血清FD70水平亦显著升高(1.53±0.80比14.32±1.27)，差异有统计学意义(P<0.05)，图6。
A．TUNEL染色：a.对照组；b.NEC组；B.肠上皮细胞凋亡率；aP<0.05；NEC：坏死性小肠结肠炎。
A．对照组；B.NEC组；红色荧光为Pan-keratin，蓝色荧光为DAPI，白色箭头所示为黏膜上皮断裂处；NEC：坏死性小肠结肠炎。
aP<0.05；NEC：坏死性小肠结肠炎。
RT-PCR检测炎症相关细胞因子后发现，与对照组相比，NEC组小鼠肠道组织促炎因子GM-CSF、IL-6和IL-12的mRNA表达水平显著上升(分别为1.00±0.05比1.83±0.17，1.00±0.13比2.00±0.58，和1.00±0.05比1.49±0.22，P均<0.05)，抗炎因子IL-10 mRNA表达水平显著下降(1.00±0.22比0.09±0.01，P<0.05)，见图7。
A．GM-CSF mRNA；B.IL-6 mRNA；C.IL-10 mRNA；D.IL-12 mRNA；aP<0.05；GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；IL：白细胞介素；NEC：坏死性小肠结肠炎。
Western blot检测小鼠肠道组织M1型巨噬细胞相关指标CD86，M2型巨噬细胞相关指标CD206蛋白表达水平的结果显示，与对照组相比，NEC组CD86蛋白表达显著增多(1.00±0.01比1.50±0.10)，CD206蛋白表达显著减少(1.00±0.01比0.60±0.05)，差异均有统计学意义(P均<0.05)，见图8。细胞流式结果亦显示，与对照组相比，NEC组小鼠肠道CD68+CD86+M1型巨噬细胞比例明显增加(1.90%±0.19%比10.20%±0.38%，P<0.05)，CD68+CD206+M2型巨噬细胞比例明显减少(5.8%±0.33%比3.7%±0.56%，P<0.05)，见图9。
A．Western blot法检测CD86和CD206的蛋白表达；B.CD86蛋白水平定量分析；C.CD206蛋白水平定量分析；aP<0.05；NEC：坏死性小肠结肠炎。
A．流式细胞术检测M1型巨噬细胞比例；B.流式细胞术检测M2型巨噬细胞比例；C.M1型巨噬细胞定量分析；D.M2型巨噬细胞定量分析；aP<0.05；NEC：坏死性小肠结肠炎。
肠道是营养吸收以及抵御病原体入侵的重要场所。其中，肠道上皮细胞与其他不同种类的细胞及微生物相互作用形成一道天然的机械、微生物及免疫屏障[12]。与足月小鼠相比，早产小鼠肠道发育不完全，肠道运动力较弱以及神经系统功能不完善，因而对外界刺激的抵抗力较低。在本研究小鼠NEC建模过程中观察到，早产小鼠经过缺氧、低温、高渗喂养等刺激后，存活率显著下降，肠道组织出现了不同程度的病理损伤，表现为以末端回肠和结肠黏膜层为主的结构破坏，具体为肠绒毛断裂或坏死，部分损伤可深入肌层组织，并伴有肠上皮细胞的凋亡增多，肠道通透性增强和肠道上皮完整性损伤，其上述改变与人NEC的表现相似[13]。肠道上皮的损伤和屏障功能的破坏，不仅直接影响机体的消化和吸收功能，更为细菌异常定植创造了有利条件，也为进一步触发免疫系统引起炎症反应起到了关键作用[14]。
肠道上皮细胞是抵抗肠道来源致病因素的第一道防线，其与巨噬细胞、固有淋巴细胞、树突状细胞等免疫细胞共同组成了肠道固有免疫屏障，在维持肠道稳态中发挥重要调节作用。巨噬细胞隶属于单核巨噬系统，具有较强的异质性与可塑性，可吞噬病原体，产生炎症因子[15]。尤其在炎症早期，肠道固有层中的巨噬细胞在调节炎症反应中起关键作用。根据其功能特征，可将巨噬细胞分为经典激活的M1型和替代激活的M2型。M1型巨噬细胞通过分泌IL-6、IL-12等细胞因子促进组织损伤；M2型巨噬细胞可通过分泌IL-10、转化生长因子-β1、肝素结合表皮生长因子而发挥抗炎和促进损伤愈合的作用，M1及M2两型的平衡在调控炎症反应及修复中发挥重要作用[15]。本研究发现，NEC组小鼠肠道病变区组织中有大量巨噬细胞浸润，其中促炎型M1型巨噬细胞显著增多，抗炎型M2型巨噬细胞显著减少，此与MohanKumar等[16]应用三硝基苯磺酸建立的小鼠NEC模型和Ginzel等[17]采用右旋糖酐硫酸酯钠灌胃建立的小鼠NEC模型的相关研究结果相似，提示巨噬细胞异常活化并向M1型极化在NEC发病过程中起到了关键的作用。
机体细胞因子水平不仅可以作为疾病及其严重程度的标志，更在肠道组织损伤和修复中发挥潜在的作用[18]。在稳态条件下，GM-CSF在机体循环中呈低水平表达，而在炎症条件下被诱导大量产生并进一步刺激巨噬细胞释放IL-6、肿瘤坏死因子等促炎因子[19]。既往已有研究表明，GM-CSF可促进巨噬细胞向M1型极化[20]。巨噬细胞分泌的IL-6、IL-12等细胞因子可激活Th1细胞，促进吞噬作用并参与抗原呈递等活动[9]。而IL-10作为一种抗炎因子，由M2型巨噬细胞产生，在炎症后期参与凋亡细胞清除，进行组织修复等过程[9]。本实验发现，NEC组小鼠肠道组织内促炎因子[9]GM-CSF、IL-6、IL-12水平上升，抗炎因子[9]IL-10水平下降。由此提示NEC发生时出现了机体免疫功能紊乱，导致促炎和抗炎因子分泌失衡，可引起巨噬细胞功能的进一步紊乱，加重巨噬细胞进一步向M1型极化，可能在促进NEC炎症反应和病情进展过程中发挥重要作用。
综上所述，本研究利用早产、缺氧、冷刺激、高渗喂养和LPS方法建立的小鼠模型，观察了NEC发病过程中肠道结构和功能的改变，探讨了巨噬细胞的活化情况及极化方向。证实NEC作为一种多因素作用的疾病，在早产儿肠道发育不成熟的基础上，在喂养、护理不当等因素刺激下，出现肠道上皮结构破坏，上皮细胞凋亡增加，通透性增强和屏障功能的破坏，由此成为NEC发病的启动因素及关键致病环节。肠黏膜稳态环境破坏和免疫反应的激活，巨噬细胞异常活化并向促炎型M1型极化，促炎因子与抗炎因子的释放失衡进一步加重肠道损伤，黏膜炎症反应呈级联式扩大，造成更为广泛的黏膜坏死及有毒物质吸收，可能是NEC发生发展出现全身感染并最终导致死亡的重要进展途径。本研究为NEC发病机制的进一步探讨和未来包括NEC在内的肠道炎症损伤性疾病的临床免疫治疗提供了理论依据。
所有作者均声明不存在利益冲突
