有前瞻性流行病学研究结果显示：在家族性胰腺癌群体中，个体患胰腺癌的风险与家族中患癌人数密切相关，3%~8%胰腺癌病人的易感基因有致病性胚系突变，该比例在有家族史的病人中更高。胰腺癌遗传易感基因以BRCA2和ATM最常见，其次是BRCA1、PALB2、CDKN2A/p16和LKB1/STK11^［11］。BRCA1、BRCA2、PALB2、ATM等是同源重组修复通路的关键基因，通过修复双链DNA断裂维持基因组完整性，同源重组修复通路基因突变引起同源重组修复功能异常（homologous recombination repair deficiency，HRRD），导致基因组不稳定^［12］。HRRD胰腺癌病人可通过诱导DNA损伤药物进行靶向治疗^［13］。如多聚（ADP-核糖）聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］负责DNA单链损伤修复。体内和体外实验结果均证明存在HRRD的肿瘤细胞对铂类药物或PARP抑制剂更敏感^{［14, 15］}。对于HRRD肿瘤，PARP抑制剂可使两种DNA损伤修复途径均出现障碍，促进肿瘤细胞凋亡，发挥强效抗肿瘤作用，即合成致死效应。Bockorny等^［16］分析同源重组修复通路基因胚系和体细胞突变对进展期胰腺癌预后的影响，其研究结果显示：262例病人中，50例存在胚系或体细胞HRRD，且两者具有相似的基因组不稳定性，在接受铂类药物一线治疗的病人中，HRRD病人疾病无进展生存率和总体生存率均优于非HRRD病人，但在未接受铂类药物治疗的病人中未发现类似结果。具有里程碑意义的POLO研究前期结果显示：具有胚系BRCA基因突变的转移性胰腺癌病人接受铂类药物一线化疗的疗效优于野生型病人^［17］。基于PARP抑制剂较好的安全性，该研究将针对BRCA基因突变的PARP抑制剂应用于胰腺癌的维持治疗，其结果显示：与安慰剂比较，PARP抑制剂奥拉帕利作为维持治疗药物，可显著延长晚期胰腺癌病人的疾病无进展生存时间（7.4个月比3.8个月，HR=0.53，P=0.004）^［17］。该研究是第一项依据生物标志物针对晚期胰腺癌施行精准治疗的大型Ⅲ期临床研究，具有重要意义。该研究使PARP抑制剂被纳入美国国立综合癌症网络（NCCN）胰腺癌指南，获得美国食品药品监督管理局批准用于胰腺癌维持治疗。更重要的是，这是胰腺癌真正迈入精准治疗时代的重要标志。

错配修复缺陷（mismatch repair deficiency，dMMR）细胞信号通路可识别并修正错配DNA碱基对。错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等）胚系突变、体细胞突变或表观遗传改变引起dMMR，导致肿瘤突变负荷升高和高度微卫星不稳定性（micro- satellite instability-high，MSI-H）^［18］。胰腺癌免疫原性较弱，并不适合免疫治疗^{［18, 19］}。然而，dMMR肿瘤由于免疫原性增强，对免疫检查点抑制剂比较敏感。Le等^［20］和Hu等^［21］的研究结果显示：接受派姆单克隆抗体治疗的dMMR和（或）MSI-H胰腺癌病人客观缓解率分别为62%和57%。而Keynote-158Ⅱ期临床试验结果显示：dMMR和（或）MSI-H的胰腺癌病人仅有18%出现客观缓解^［22］。以上研究结果说明仍需额外的生物标志物帮助筛选从免疫检查点抑制剂获益的dMMR和（或）MSI-H胰腺癌病人。

KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4是胰腺癌最常见的体细胞突变基因，90%的病人存在KRAS癌基因功能突变，25%~80%病人存在TP53、CDKN2A和SMAD4抑癌基因功能缺失突变^［23］。目前仍缺乏特异性靶向KRAS的有效药物。而野生型KRAS胰腺癌病人通常存在其他RAS途径基因改变。其中部分基因突变是现有疗法的靶点，如BRAF突变、ERBB2扩增以及NRG1、RET或NTRK基因融合。NTRK基因融合在胰腺癌中发挥致癌驱动作用。虽然NTRK基因融合只存在于1%的胰腺癌中，但由于小分子酪氨酸激酶抑制剂（如恩曲替尼和拉罗替尼）的出现，这一亚型引起研究者的关注^［24］。Pishvaian等^［25］的研究结果显示：3例发生NTRK或ROS1基因融合的胰腺癌病人对恩曲替尼均有持续的部分应答。

胰腺癌病人中，BRCA1、BRCA2突变占8%，dMMR和（或）MSI-H仅占1%~2%，NTRK融合占1%，而其他类型病人仍缺乏有效的精准治疗手段。在临床实践中通常未对具备这些特征的胰腺癌病人进行筛选，且在经过筛选的病人中接受匹配治疗的比例仍然较小。2020年，Pishvaian等^［26］回顾性分析“Know Your Tumor（KYT）了解您的肿瘤”项目中分子匹配治疗胰腺癌病人的生存状况：677例病人最终纳入分析，189例病人存在具有治疗指导意义的分子改变，其中46例接受匹配治疗。该研究中匹配治疗包括对dMMR病人给予免疫检查点抑制剂治疗，对存在HER2异常扩增或激活的病人给予HER2抗体治疗，对存在同源重组DNA损伤反应和修复通路基因改变的病人给予PARP抑制剂或ATR抑制剂治疗，对存在ROS1、NTRK基因融合的病人给予TRK抑制剂治疗，对存在BRAF-V600E突变的病人给予RAF-MEK靶向治疗。其结果显示：接受分子匹配治疗病人的总体生存时间显著长于未接受匹配治疗的病人（2.58年比1.51年，HR=0.42，P=0.000 4），也显著长于不具治疗指导意义分子改变的病人（2.58年比1.32年，HR=0.34，P<0.000 1）。

目前NCCN、美国临床肿瘤学会和中国临床肿瘤学会（CSCO）已更新相应指南，推荐胰腺癌分子突变筛选。如2020版CSCO胰腺癌诊疗指南将BRCA1、BRCA2、PALB2、NTRK基因检测、dMMR和MSI检测增加至Ⅰ级推荐，并注明如存在BRCA1、BRCA2或PALB2基因突变，可考虑使用含铂类的化疗方案；存在NTRK基因融合，靶向NTRK治疗可能使病人获益；存在dMMR或MSI-H，免疫治疗可能使病人获益。

2008年，Jones等^［27］首次尝试对胰腺癌进行基因组全景分析，采用新一代测序技术分析24例中晚期（Ⅱb~Ⅳ期）胰腺癌病人，以检测蛋白质编码基因的结构变异和体细胞突变。该研究结果显示：胰腺癌平均包含63个基因改变，鉴定出69个显著变化的关键基因，可以归类为12条核心信号通路。

2011年，Collisson等^［28］利用基因表达芯片分析27例胰腺癌术后病人，建立包含62个基因的特征谱，将胰腺癌分为经典型、准间质型和类外分泌型3个亚型。经典型胰腺癌中，GATA6和KRAS高表达，而准间质型胰腺癌中GATA6低表达或无表达。有细胞实验结果显示：准间质型胰腺癌细胞对吉西他滨更敏感，而经典型对厄洛替尼更敏感，经典型病人预后最好，准间质型预后最差^［28］。该研究首次尝试将胰腺癌分成不同的分子亚型。

2015年，Moffitt等^［29］利用基因芯片和全转录组测序分析206例未经治疗胰腺癌病人肿瘤组织（145例原发灶和61例转移灶）的表达谱数据，发现4种亚型，即与胰腺癌间质相关的普通型和活化型，与胰腺癌相关的经典型和基底样型。经典型胰腺癌高表达转录因子GATA6，与Collisson等^［28］研究中的经典型一致，预后最好。基底样型胰腺癌分子特征类似基底样型膀胱癌和基底样型乳腺癌，层黏连蛋白和角蛋白高表达；且胰腺癌转移灶与原发灶的分子分型具有一致性，以基底样型为主。胰腺癌间质的分子分型是影响病人预后的独立因素。基底样型（不论间质呈普通型或活化型）胰腺癌和间质呈活化型的经典型胰腺癌病人预后较差，基底样型胰腺癌病人行新辅助治疗获益显著，且间质活化程度可显著影响病人对治疗的反应程度。2017年，Martinelli等^［30］研究胰腺癌病人特定转录亚型与辅助治疗临床反应之间的关系。该研究利用ESPAC-3试验的大数据集，根据GATA6基因表达水平对病人进行分类，结果显示：GATA6高表达（经典型）的病人从5-氟尿嘧啶辅助治疗中获益更大，而GATA6中等或低表达病人（基底样型）不能从5-氟尿嘧啶辅助治疗中受益，但未发现GATA6亚型与吉西他滨辅助治疗反应之间的关系^{［30, 31］}。在COMPASS试验中，对于基底样型的胰腺癌，接受吉西他滨联合紫杉醇治疗的病人生存时间优于接受mFOLFIRINOX治疗的病人^［32］。

2016年，Bailey等^［33］对456例胰腺癌病人进行整合基因组和转录组分析，并将胰腺癌分为4种亚型：鳞状细胞型、胰腺祖细胞型、异常内分泌分化的外分泌型及免疫原性型。这4种亚型具有独特的组织学特征并与病人预后密切相关：鳞状细胞型常见于腺鳞癌，病人中位生存时间为13.3个月，预后最差；胰腺祖细胞型和免疫原性型常见于黏液非囊性癌和起源于胰腺导管内乳头状腺瘤的黏液癌，胰腺祖细胞型病人中位生存时间为23.7个月，免疫原性型为30.0个月；异常内分泌分化的外分泌型常为腺泡细胞癌，病人中位生存时间为25.6个月。此外，免疫原性型与较强的免疫浸润相关，这提示免疫治疗药物可能发挥作用。

2017年，Connor等^［34］通过全基因组测序结合表达谱综合分析160例胰腺癌组织标本（148例原发灶和12例匹配的转移灶）将胰腺癌分为4种亚型，即年龄相关型、双链断裂修复型、错配修复型和病因不明型。研究者将上述分型在95例胰腺癌病人中进行验证，结果显示：同一病人的原发灶和转移灶之间表达谱具有一致性。然而，上述分子分型与胰腺癌分级、分期以及病人预后均无相关性，临床意义有限。其潜在应用价值在于双链断裂修复型和错配修复型中CD8⁺ T淋巴细胞激活和肿瘤免疫调节分子过度表达，这可为特定亚型病人的免疫治疗、疗效监测及新型靶向药物研发提供理论依据。

2018年，Puleo等^［35］分析309例胰腺癌切除标本的基因组和转录组，证实了基底样型和经典型胰腺癌分子分型的可靠性。研究者进一步将胰腺癌分为纯基底样型、间质活化型、结缔组织增生型、纯经典型和免疫经典型5种亚型。纯基底样型、纯经典型、免疫经典型主要受肿瘤成分影响，结缔组织增生型和间质活化型主要受微环境和间质的影响。免疫经典型中存在NK细胞、T细胞和B细胞的高度浸润，其中CTLA4表达在所有亚型中最高，这使得免疫经典型对免疫检查点抑制剂如ipilimumab具有潜在的敏感性。纯基底样型免疫浸润程度低，主要由低分化肿瘤组成，CDKN2A或TP53突变较多，预后最差，病人中位生存时间为10个月，而纯经典型和免疫经典型病人中位生存时间则分别为43.1个月和37.4个月。

Chan-Seng-Yue等^［36］用全基因组和转录组分析314例胰腺癌病人（Ⅰ~Ⅱ期占62%、局部进展期占6%、Ⅳ期占31%）的330份肿瘤样本，重新定义5个胰腺癌分子亚型：基底样A型、基底样B型、经典A型、经典B型和混合型。上述亚型的分子特征和临床特征差异巨大。早期胰腺癌以经典A或B型肿瘤为主（Ⅰ期或Ⅱ期占62%、Ⅳ期占46%），经典A型最常见（Ⅰ期或Ⅱ期占44%、Ⅳ期占36%）。基底样亚型在胰腺癌病人中的分布在各疾病分期存在差异：基底样A型在早期肿瘤非常少见（占所有Ⅰ期或Ⅱ期病人的5%），但在所有Ⅳ期病人中占24%。相反，基底样B型在早期肿瘤（Ⅰ~Ⅲ期）占主导地位。研究者还探讨胰腺癌不同转录亚型与晚期病人生存结果的相关性。在80例接受mFOLFIRINOX或以吉西他滨为基础治疗方案的Ⅲ~Ⅳ期胰腺癌病人中，基底样A型病人较其他亚型病人预后差。该研究分析其中66例病人对化疗的客观缓解率，无论采取何种化疗方案，基底样A型病人的客观缓解率最差，70%的基底样A型病人处于进展期^［36］。

组织块转录组技术不能解决胰腺癌微环境的巨大复杂性，单细胞转录组技术有助于深入了解胰腺癌的病理生理学机制。2018年，Bernard等^［37］首次将scRNA-seq应用于胰腺癌。2019年，Peng等^［38］制作了目前最庞大的胰腺癌单细胞转录图谱，让研究者能初步了解这种疾病的整个细胞生态系统。该研究分析24例胰腺癌切除标本中的41 986个单细胞和11例对照胰腺中的15 544个单细胞，对肿瘤标本中所有细胞的差异表达基因进行主成分分析，发现了10个主要细胞簇。Chan-Seng-Yue等^［36］进一步对15例胰腺癌病人（13例早期癌和2例Ⅳ期癌）进行scRNA-seq检测，结果显示：绝大部分病人肿瘤中同时发现经典型和基底样型癌细胞团，两者比例呈负相关，这显示出单细胞分析在描述癌症表型中的优势。

2018年，Wartenberg等^［39］对110例胰腺癌的热点癌基因进行测序并利用组织芯片检测肿瘤微环境，通过肿瘤微环境中的免疫细胞特点将胰腺癌分为免疫逃逸型、免疫富集型和免疫耗竭型。免疫逃逸型预后最差，免疫富集型预后最好。

综上，笔者认为：目前胰腺癌分子分型尚未发挥良好的分类及治疗指导作用，如何利用大样本量胰腺癌组织的高通量测序分析结果，更加直观、便捷地定义不同的病人亚群，进而探索各自潜在的治疗靶点，发掘对应治疗方案，提高病人预后，仍需进一步研究。

CTCs可存在于任何分期的大多数胰腺癌病人中^［48］。CTCs具有显著的肿瘤异质性。如CTCs可表现为上皮型、间质型和混合型。上皮型和间质型分别表达其典型的标志物，即E-cadherin和vimentin^［49］。而混合型由经历上皮间质转化或间质上皮转化程序的肿瘤细胞组成，同时表达两种标志物^{［50, 51］}。目前已有系列研究对CTCs在胰腺癌中的临床意义进行评价。Buscail等^［52］对18项相关研究进行综述，结果显示：在不同平台上胰腺癌CTCs的检出率为11%~100%，两项研究检测到治疗前后（治愈性手术或姑息治疗）CTCs的变化，还有13项研究结果证实CTCs的存在提示预后较差。Ankeny等^［53］的研究结果显示：胰腺癌隐匿性转移病人的CTCs高于无转移病人，表明胰腺癌病人血液中CTCs计数升高，即使影像学检查未发现转移，也应优先考虑全身化疗而非手术治疗。近年来，新辅助治疗对边界可切除胰腺癌和可切除胰腺癌的疗效已有报道^{［54, 55］}。新辅助治疗的疗效通常需在疗程结束后通过CT检查和肿瘤标志物评估。然而，部分胰腺癌病人很可能未从新辅助治疗中获益，甚至在治疗过程中发生疾病进展。因此，这些病人有错失根治性手术治疗的风险。CTCs检测可能有助于避免这种不利的临床结果。大多数研究仅检测上皮型CTCs数目或总CTCs数目。Poruk等^［56］的研究结果显示：上皮型CTCs是胰腺癌术后病人预后的独立预测因素，而混合型CTCs则是术后肿瘤复发的预测因素，此外具有肿瘤干细胞表型的CTCs同样是胰腺癌术后病人预后的预测因素。Gemenetzis等^［57］检测可切除胰腺癌中的总CTCs和CTCs亚型，结果显示：新辅助化疗与手术治疗均减少CTCs亚群，可作为12个月内肿瘤复发的预测指标。Wei等^［58］的研究结果显示：vimentin阳性的CTCs可用于区分胰腺癌病人与健康人群，此类CTCs在化疗后显著降低，并与无复发生存时间缩短相关。Sun等^［59］的研究结果显示：混合型CTCs是良好的转移预测因素，而上皮型CTCs是胰腺癌病人总体生存的重要独立预测因素。由此可见，CTCs在胰腺癌中的早期诊断、评估预后、验证疗效、指导治疗的潜在价值十分巨大。

循环肿瘤DNA可为临床医师提供有关胰腺癌的生物学信息，因为其含有特定病人癌症过程的突变或表观遗传学特征。由于肿瘤内的异质性和抽样错误，活组织病理学检查中未检测到的突变可能在液体活组织病理学检查中被检测到^［60］。KRAS是胰腺癌最常见的基因突变，已成为基于循环肿瘤DNA分析的主要目标^［61］。一项纳入使用不同分离方案、基因位点和表观遗传标记对循环肿瘤DNA进行检测的荟萃分析结果显示：循环肿瘤DNA诊断胰腺癌的合并灵敏度仅为0.64^［62］。这提示在胰腺癌早期，可能无足够数量的肿瘤细胞坏死，导致可检测的循环肿瘤DNA不足。循环肿瘤DNA与其他血液标志物如CA19-9联合检测可提高筛查胰腺癌的灵敏度和特异度^［63］。在预后方面，一项研究结果显示：循环肿瘤DNA>0.6%的病人预后较差，<0.6%的病人预后较好^［64］。基于循环肿瘤DNA的液体活组织病理学检查可检测出有利于靶向治疗的突变，特别是在转移性胰腺癌中，可为接受标准治疗方案的病人施行针对性靶向治疗。循环肿瘤DNA与转移灶的符合率高于原发灶肿瘤组织^{［64, 65, 66］}。转移性病变可能包含原发灶活组织病理学检查中不存在的靶向突变。液体活组织病理学检查可诊断这些靶向突变，拓宽治疗选择，在此背景下，循环肿瘤DNA正被积极探索为指导全身治疗的一种手段^［67］。对于可切除原发性肿瘤，评估可切除性是胰腺癌多学科管理的关键。R₀切除术后5年远处转移率为80%，这表明目前尚无一种已经应用于临床的检测方法能在术前阶段充分检测全身疾病^{［68, 69］}。基于循环肿瘤DNA的液体活组织病理学检查可能对判断胰腺癌是否存在隐匿性转移具有一定价值。这可让不能从手术中获益的病人避免非必要的手术，并可能作为病人选择术前综合治疗的依据。

一项针对早期可切除胰腺癌病人的研究结果显示：1年复发率为35%，而交界性可切除胰腺癌病人的1年复发率>80%^［70］。早期发现肿瘤复发是启动适当系统治疗的关键。胰腺癌复发或进展的监测涉及传统肿瘤标志物和CT检查。循环肿瘤DNA可提供更早的检测窗和靶向治疗的机会^［71］。循环肿瘤DNA的半衰期很短（以小时计），这是在较短时间间隔内评估治疗反应的理想方法^［72］。一项研究结果显示：在10例胰腺癌复发病人中，基于循环肿瘤DNA的液体活组织病理学检查能在3.1个月后发现疾病进展，而标准的CT检查则需9.6个月^［73］。另一项研究结果显示：术后循环肿瘤DNA阳性的13例胰腺癌病人均发生术后复发，而在22例术后循环肿瘤DNA阴性的病人中，只有10例在术后38个月复发^［74］。Groot等^［70］的研究结果显示：循环肿瘤DNA是无复发生存和总体生存的独立预测因子。Lee等^［75］的研究结果显示：循环肿瘤DNA可作为可切除胰腺癌病人术后吉西他滨辅助化疗是否获益的标志物，无论是否进行辅助化疗，术后循环肿瘤DNA阳性均预示疾病复发和不良预后。最新研究证明：检测循环肿瘤DNA中KRAS突变，尤其是KRAS G12D突变可作为预测可切除胰腺癌预后的生物标志物。由于与微转移高度相关，术前检测KRAS G12D突变有助于优化可切除胰腺癌的手术选择^［76］。

外泌体是由所有类型细胞（包括癌细胞）分泌的直径为50~150 nm细胞外囊泡，其内部含有DNA、微核糖核酸和蛋白质。外泌体的循环半衰期比循环肿瘤DNA长，且癌细胞不断产生外泌体，因此，外周循环捕获外泌体不依赖于细胞坏死、凋亡或侵袭等。这些特征有助于更早检测外泌体^{［77, 78, 79］}。在胰腺癌治疗领域内，外泌体研究较多，但目前尚未广泛应用于临床。将外泌体用于监测治疗反应或作为胰腺癌预后工具的研究仍然很少。外泌体蛋白质和基因分析在诊断、筛查和靶向治疗中可能有用^{［80, 81］}。整合素在外泌体上的表达呈现出一种反映器官特异性的模式，有助于预测器官特异性转移^［82］。Melo等^［83］在肿瘤来源的外泌体上发现细胞表面蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1，而磷脂酰肌醇聚糖-1阳性外泌体水平与胰腺癌手术前后的肿瘤负荷及生存率相关。肿瘤来源的外泌体水平与肿瘤分期和转移有关，可反映手术和治疗反应^{［83, 84, 85］}。

笔者认为：未来结合影像学检查，以CTCs、循环肿瘤DNA和外泌体为代表的生物标志物建立新的胰腺癌分期系统将成为极具潜力的发展方向。基于新的胰腺癌分期系统，更加精准地筛选病人，开展个体化治疗，从而为每例胰腺癌病人的获益尽最大努力。为达成以上目标，需开展更深入的基础研究和更广泛的前瞻性临床研究。