探讨特殊染色技术在艾滋病合并真菌病理诊断中的应用价值。
选取2010年2月至2013年11月上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心确诊为艾滋病合并真菌感染的患者20例，回顾性分析经苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸希夫染色(PAS)和六胺银染色的病理资料，观察常见真菌在光镜下的形态。
20例艾滋病合并真菌感染的患者中，肺部隐球菌2例，皮肤、肺、腹腔肠系膜淋巴结马尔尼菲青霉菌3例，会厌、颈部淋巴结、口腔、腹腔及皮肤组织胞浆菌5例，上颌窦、肺及声带曲霉4例(合并结核3例)，肝、咽、食道及胃部白色假丝酵母菌6例。HE染色组织中炎性细胞浸润，可见肉芽肿形成，凝固性坏死，真菌形态尚能辨认，但需仔细观察，否则易漏诊或误诊；PAS染色，真菌孢子和假菌丝呈亮丽的紫红色，细胞核紫蓝色；六胺银染色，真菌孢子和假菌丝呈清晰可辨的黑褐色。
除常规进行HE染色外，联合应用PAS染色和六胺银染色，有助于提高真菌的病理诊断率。
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随着疾病的进展，艾滋病患者CD4＋T淋巴细胞亚群减少，细胞免疫功能与体液免疫功能逐渐降低，常并发各种机会性感染，最常见的是真菌感染。艾滋病合并真菌感染是艾滋病患者就诊、入院、致死的重要原因之一。尤其是深部真菌感染起病较为隐匿，表现复杂多样，给早期诊断、及时治疗及改善预后等带来极大困难[1,2]。本研究应用特殊染色技术对艾滋病合并真菌感染患者的组织样本进行检测，并对真菌的形态和病理改变进行综合分析，旨在提高临床上艾滋病合并真菌感染诊断的正确率。
选取2010年2月至2013年11月上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心确诊为艾滋病合并真菌感染的患者20例，分析患者经苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸希夫染色(PAS)和六胺银染色的病理资料，其中男性18例，女性2例，年龄20～53岁，中位年龄42.5岁。20例患者临床表现为不同程度发热14例，咳嗽6例，咽喉部疼痛不适3例，饭后胃疼2例，皮肤溃疡伴脱屑2例，口腔黏膜溃疡伴白色假膜及牙龈肿块1例，腹痛、腹泻2例，吞咽困难2例，鼻塞、流脓涕及间歇性头痛2例。入院前均未确诊和进行抗真菌治疗。
HE染色试剂、PAS染色液和六胺银染色液均购自珠海贝索生物技术有限公司。
组织经4%中性甲醛溶液固定，行常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度3～4 μm。60 ℃烤片机烤片1 h，HE染色，二甲苯透明，中性树胶封固。
切片脱蜡至蒸馏水后，高碘酸液氧化10 min，流水冲洗2 min，再用蒸馏水洗2次，入Schiff试剂10～15 min，充分水洗，Harris苏木素行对比染色1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性胶封固。
切片脱蜡至蒸馏水后，高碘酸液氧化10 min，蒸馏水充分洗涤，入六胺银硼砂染色液于60 ℃水浴箱内反应60 min，至切片呈黄褐色，即在镜下观察真菌呈黑褐色为止。蒸馏水洗，氯化金调色3 min，蒸馏水稍洗，硫代硫酸钠处理3 min，水洗，伊红染1 min，然后脱水、透明、封片。
采用HE染色，大多真菌呈浅蓝色；采用PAS法，真菌孢子和假菌丝呈亮丽的紫红色，细胞核呈紫蓝色；采用六胺银法，真菌孢子和假菌丝呈清晰可辨的黑褐色。
该菌一般在组织间隙、单核细胞或多核巨细胞的细胞质内见隐球菌的菌体，部分可聚集成堆，并分泌黏液。常规HE染色仅显示淡蓝色，大小不一的圆形小体，直径为2～20 μm，高倍镜下胞体周围有环状透亮光晕(多糖厚荚膜)，若不仔细观察易漏诊(图1a)；PAS染色，菌体和荚膜均呈紫红色(图1b)；六胺银染色，菌体和荚膜均呈黑褐色，清晰可见(图1c)。
注：a.肺组织中隐球菌呈圆形及椭圆形，淡染，菌体周围有一明显的空晕(多糖厚荚膜不被着色)(HE×1 000); b．隐球菌的菌体及多糖胞壁呈紫红色(PAS×400); c．隐球菌的菌体及胞壁呈黑褐色(六胺银×400); d．腹膜组织中隐约可见马尔尼菲青霉菌呈蓝色，位于泡沫样空隙中呈圆形、椭圆形及杆状，体积较小(HE×400); e．马尔尼菲青霉菌呈明显的腊肠状，两端钝圆，中间有一横隔被染成紫红色，菌体粉染或紫色(PAS×1 000); f．马尔尼菲青霉菌菌体及横隔呈黑褐色(六胺银×1 000); g．腹腔活检组织中可见组织胞浆菌位于巨噬细胞内，呈圆形、椭圆形，淡篮染，菌核周围有空晕(HE×400); h．组织胞浆菌被染成紫红色，核周有空晕(PAS×1 000); i．组织胞浆菌被染成黄褐色，核被染成黑褐色，周围有空晕(六胺银×1 000); j．肺组织中见曲霉假菌丝呈分生孢子梗，部分孢子脱落，均呈淡蓝色(HE×100); k．曲霉被染成紫红色，菌丝呈小球和小囊状，有分枝(PAS×400); l．曲霉被染成黑褐色，有分隔，其分枝呈45°，假菌丝呈竹节样(六胺银×400); m．肝组织中见白色假丝酵母菌的孢子伸长成芽管，其内有空泡，另见厚壁孢子及假菌丝(HE×400); n．白色假丝酵母菌假菌丝带有球状的芽生孢子，厚壁孢子呈圆形(PAS×400); o．白色假丝酵母菌假菌丝和芽管均可见较短分枝，假菌丝有分隔，芽管呈葫芦状，大多孢子与菌丝不分离(六胺银×400)
该菌大多在细胞外组织间，也可位于单核或多核巨噬细胞体内，成簇生长。HE染色呈蓝色，细胞内真菌呈卵圆形至椭圆形，长管形或马蹄形酵母细胞，一般直径为3～4 μm，细长的细胞可长达8 μm，腊肠状横隔不太明显(图1d)；PAS染色，油镜下观察，大部分呈桑棋状或葡萄状聚集，细胞壁红染，细胞质着色浅或不着色，部分呈腊肠状结构，两端钝圆，有清晰的紫红色横膈(图1e)；经六胺银染色后，细胞壁及腊肠状横膈被染成黑褐色(图1f)。
通常菌体在细胞内，呈圆形或卵圆形单个芽生细胞，直径为1～5 μm，HE染色可见细胞壁外有一透亮空晕(图1g)，易被误认为未染色的荚膜；PAS染色呈红色，细胞壁外空晕不着色，证明此空隙并非黏多糖荚膜(图1h)；六胺银染色菌体呈黄褐色，胞核呈黑褐色(图1i)。
肺部隐球菌2例，皮肤、肺、腹腔肠系膜淋巴结马尔尼菲青霉菌3例，会厌、颈部淋巴结、口腔、腹腔及皮肤组织胞浆菌5例，上颌窦、肺及声带曲霉4例(合并结核3例)，肝、咽、食道及胃部白色假丝酵母菌6例。
艾滋病合并真菌感染是艾滋病患者常见的死亡原因之一。随着高效抗反转录病毒治疗以及新型抗真菌药物在临床的广泛使用，艾滋病患者合并侵袭性真菌感染的疾病谱也发生变化，一些地方性或少见的真菌感染在艾滋病患者中出现。侵袭性真菌感染的早期诊断对于改善患者预后至关重要[3,4]。目前深部真菌病的早期诊断有一定的难度，如体液直接涂片镜检阳性率不高，真菌培养至少需要一周时间，分子生物学诊断难度大、花费高，且需进行临床评价。因此若能够取到合适的病变器官或活检组织样本，及时进行病理组织学检查，结合一些特殊染色方法就可以早期确诊深部真菌病。同时组织病理学检查耗时相对较短，一般为2～3 d，甚至可短至24 h，并且可以显示真菌在组织内的侵袭情况及宿主的反应。
真菌在组织中用HE染色一般着色不佳，不留心观察易漏诊，因此需用特殊染色方法显示，最常用的是PAS和六胺银法。PAS染色法的原理是由于各种真菌菌壁都含有多糖类物质，而高碘酸能氧化真菌菌壁的多糖使得暴露出醛基，醛基与无色品红结合又能生成新的品红复合物，而真菌通过新合成的品红复合物显色，背景由苏木素复染，呈现出淡紫蓝色。染色时首先应注意的是氧化时间一般控制在10 min以内，环境温度不超过20 ℃为宜。室温稍高则氧化时间应适当缩短。若温度高作用时间长，可使某些物质成分发生非特异性反应，结果会出现假阴性。其次是Schiff试剂在染色时，应提前取出恢复到室温使用，较理想的Schiff试剂应为无色清亮溶液，溶液出现淡红色时表明试剂已失效。Schiff染色时间上差异较大，一般较高温度时为10 min，较低温度为20 min。六胺银法是用过碘酸氧化真菌内的多糖化合物而暴露出醛基，醛基还原六胺银成为黑色的金属银，用氯化金调色，把金属银再转化为更稳定的金属金，通过硫代硫酸钠处理，除能洗去切片上未起反应的银离子，并可排除组织中的黄色色调。六胺银最大的优点是对各类真菌都很敏感，染色深黑，在镜下极易观察。染色时首先应注意银染色系化学反应过程，要求所使用的试剂、溶液和器皿均须达到洁净，以避免水和容器因不干净带来的杂质与银发生化学反应，影响染色质量甚至造成脱片使染色失败。其次六胺银硼砂染色液要现配现用，在恒温箱内染色60 min后，先取出一张切片，用蒸馏水洗去银液，如果染色较淡，可再回到染色液中。此外溶液应放在4 ℃冰箱内保存[5,6]。
PAS染色步骤较简单，影响因素较少，实验结果相对稳定，PAS不但可以应用于真菌染色，还可以应用于糖原、中性黏液、脂褐素及阿米巴滋养体等多种物质的染色[7]，但染色的敏感性稍不如六胺银染色。六胺银染色对各类真菌都较敏感，深黑褐色，在镜下极易辨认，但该法染色步骤相对复杂，染色时间较长，染色条件的差异对染色结果会产生影响。
值得注意的是，真菌感染的诊断目前仍然根据病理检查，首先在病灶内找到真菌孢子和(或)菌丝，即使一开始难以辨清它的真面目，尔后再依靠特殊染色技术分型仍可确认。同时在组织中也能发现肉芽肿、单核细胞、类上皮、多核巨细胞、中性粒细胞及坏死等特征性病变。但艾滋病患者由于CD4＋T淋巴细胞计数减少，机体大多出现无反应性病变，无疑增加了诊断的难度，微生物形态的识别就尤显重要。同时要与结核、寄生虫等具有坏死的上皮样肉芽肿性传染病相鉴别，前者需要抗酸染色找到抗酸杆菌，后者一定要找到寄生虫虫体，或结合血清特异性抗体检测进一步证实。另外，镜下真菌的形态鉴别在诊断中也非常重要，因为它们的致病性、分布和预后有所不同。本组收集病例中最易混淆的是组织胞浆菌与马尔尼菲青霉菌，两菌大小相近，均可在细胞内生长，易全身扩散，预后不佳。关键是在马尔尼菲青霉菌中可找到两端钝圆的腊肠样横隔，多在胞外生长[8,9]。其次是隐球菌与组织胞浆菌的鉴别，前者HE染色胞体周围有环状透亮光晕，PAS和六胺银染色，菌体和透亮晕均分别呈紫红色和黑褐色，说明隐球菌有一层多糖厚荚膜。组织胞浆菌HE染色也可见细胞壁外有一透亮空晕，但PAS和六胺银特殊染色的病原体细胞壁外空晕不着色，证明此空隙并非黏多糖荚膜，借此可与隐球菌鉴别。再则是白色假丝酵母菌与曲霉的鉴别，前者孢子伸长成芽管，管内有空泡状结构，假菌丝常带有球状芽生孢子。后者的假菌丝有节杆状分隔，分枝约呈45°的锐角[10,11]。
本组患者是一组特殊人群，CD4＋T淋巴细胞计数低下，感染的机会性增加，感染部位特殊。尤其病理确认曲霉感染的3例患者，发生在声带、上颌窦较少见，当时影像、细菌培养均诊断为结核，高烧不退，取活检发现大量曲霉，抗真菌治疗后症状缓解。皮肤、腹腔肠系膜淋巴结的活检后HE染色可疑组织胞浆菌，特殊染色后发现腊肠结构中间有横隔才最终确诊为马尔尼菲青霉菌。
总之，在组织中真菌的显示方面，PAS和六胺银两种染色方法各有优缺点，联用两种染色可提高真菌检测的阳性率。技术上应严格把握试剂的温度和染色时间，从而能使病理医师准确地作出诊断和分类，为临床医师提供确切依据，使患者及时得以治疗，提高预后和生活质量。
