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革兰阴性杆菌是临床呼吸科常见的病原菌，其致病的重要物质是脂多糖(LPS)。人类单核细胞表面表达CD14分子是LPS的受体，近年来研究显示，单核细胞按照CD14和CD16的表达水平不同可分为三个亚群：单核细胞1型[经典型，CD14(＋＋)CD16(－)CCR2(＋)，Mon1]、单核细胞2型[中间型，CD14(＋＋)CD16(＋)CCR2(＋)，Mon2]和单核细胞3型[非经典型，CD14(＋)CD16(＋＋)CCR2(－)，Mon3]，它们在炎症反应中起不同的作用[1,2]。本研究对34例革兰阴性杆菌感染患者不同单核细胞亚群的分布情况进行了检测，并与其他实验室指标进行比较，从而为革兰阴性杆菌感染的诊断、治疗和发病机制提供新的依据。
34例肺部感染病例均为江苏省泰州市人民医院2014年11月至2015年4月感染科的住院患者，其中男性19例，女性15例，平均年龄(35±12)岁。所有病例均经痰培养检查确诊为革兰阴性杆菌感染，其中铜绿假单胞菌感染11例、肺炎克雷伯菌感染9例、大肠埃希菌感染8例、阴沟肠杆菌感染4例，奇异变形杆菌感染2例。排除肝功能或免疫功能异常，有长期慢性病史，存在手术应激等患者。另外选择同期体检的27名健康者作为对照组，其中男性16名，女性11名，平均年龄(33±9)岁。两组研究对象的性别和年龄差异均无统计学意义(χ2＝0.000，t＝0.720，P值均>0.05)。
FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，用CELLQuest软件获取和分析实验数据。鞘液用Cellpack血细胞稀释液(Sysmex公司)。CD45－PerCP(编号347464)、CD14－FITC(编号347493)和同型对照鼠IgG 2a－FITC(编号349051)由BD Bioscience公司提供；PE标记的鼠抗人CD16(Clone：3G8)同型对照、鼠IgG1－PE(clone：349043)由BD Phamingen公司提供；C－反应蛋白(CRP)试剂盒由Roche公司提供、单核细胞趋化蛋白1(MCP－1)、白细胞介素6(IL－6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒由R&D公司提供。
所有受试者均抽取外周血2 mL，EDTA－K2抗凝，在6 h内测定样本。将试管分为两组，A组加入CD45－PerCP和CD14－FITC、PE标记的鼠抗人CD16 20 μL，同型对照用CD45－PerCP和鼠 IgG2a、鼠IgG1－PE 20 μL；将样本充分混匀，分别加50 μL样本于上述两组试管中，震荡器上充分混匀，避光放置15 min；加入溶血素2 mL，充分震荡，避光放置10 min。500×g离心5 min弃上清液，加入等渗氯化钠溶液2 mL震荡，500×g离心5 min弃上清液，加入等渗氯化钠溶液100 μL，充分震荡混匀，待测。
用FACS Calibur流式细胞仪自带软件FACSComp自动校正仪器的FSC、SSC、FL1、FL2、FL3的电压及补偿。用CellQuest软件获取2 000个单核细胞进行分析。选取CD45＋细胞进行分析，分别以同型对照管调整Mark的位置。在同等的实验条件下，用以分析测定管。
患者入院24 h内采清晨空腹静脉血，于4 h内完成常规检测，同时采集外周血EDTA－K2抗凝血，混匀。在Sysmex公司XE－2100血球计数仪上统计白细胞(WBC)计数、中性粒细胞百分比 、单核细胞百分比 、淋巴细胞百分比，单核细胞计数。CRP采用免疫比浊法的原理检测、MCP－1、IL－6采用ELISA双抗夹心法原理检测，按说明书操作进行检测。
采用SigmaPlot 12.0软件进行统计学分析。正态分布数据以
±s表示，采用t检验，采用Pearson进行相关性分析，治疗前后的比较采用重复测量的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
与健康对照组比较，革兰阴性杆菌感染患者WBC计数、中性粒细胞百分比、MCP－1、IL－6、CRP、单核细胞计数及百分比、Mon1和Mon2细胞数量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。
革兰阴性杆菌感染组和健康对照组单核细胞及其不同亚群表达情况的比较
革兰阴性杆菌感染组和健康对照组单核细胞及其不同亚群表达情况的比较
| 组别 | 例数 | WBC(×109 /L) | 中性粒细胞百分比(%) | MCP－1(pg/mL) | IL－6(pg/mL) | CRP(mg/L) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 革兰阴性杆菌感染组 | 34 | 11.4±2.5 | 68.6±12.6 | 467± 91 | 2.1±1.2 | 26.3±18.8 |
| 健康对照组 | 27 | 6.9±2.4 | 58.6± 5.7 | 256±125 | 1.4±0.9 | 3.2± 1.4 |
| t值 | － | 7.182 | 3.813 | 7.606 | 2.436 | 6.347 |
| P值 | － | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.05 | <0.01 |
| 组别 | 例数 | 单核细胞百分比(%) | 单核细胞计数(×109 /L) | 单核细胞亚群计数(×109 /L) | ||
| 1型 | 2型 | 3型 | ||||
| 革兰阴性杆菌感染组 | 34 | 10.4±2.2 | 0.665±0.341 | 0.556±0.295 | 0.050±0.030 | 0.059±0.045 |
| 健康对照组 | 27 | 7.6±2.1 | 0.514±0.177 | 0.388±0.123 | 0.024±0.012 | 0.045±0.010 |
| t值 | － | 5.002 | 2.086 | 2.765 | 4.208 | 1.539 |
| P值 | － | <0.01 | <0.05 | <0.01 | <0.01 | >0.05 |
注："－"．无相关数据；WBC.白细胞；MCP－1.单核细胞趋化蛋白－1；IL－6.白细胞介素－6；CRP.C－反应蛋白
Mon1、Mon2与白细胞计数、CRP、MCP－1、IL－6水平均呈正相关(P<0.05)，Mon3仅与IL－6呈正相关(P<0.05)(表2)。
34例革兰阴性杆菌感染患者单核细胞不同亚群与实验室指标的相关性系数(r)
34例革兰阴性杆菌感染患者单核细胞不同亚群与实验室指标的相关性系数(r)
| 单核细胞亚群 | 白细胞计数 | C－反应蛋白 | 单核细胞趋化蛋白－1 | 白细胞介素－6 |
|---|---|---|---|---|
| 1型 | 0.681 | 0.415 | 0.420 | 0.520 |
| 2型 | 0.515 | 0.563 | 0.344 | 0.546 |
| 3型 | 0.165a | 0.301a | 0.302a | 0.391 |
注：aP>0.05
连续监测10例革兰阴性杆菌感染患者，分别于治疗前、治疗3 d和7 d检测单核细胞不同亚群，结果显示：治疗后3 d与治疗前比较，Mon2显著降低，Mon3显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗7 d与治疗前相比，Mon1、Mon2显著下降(P<0.05)，Mon3显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。
革兰阴性杆菌感染患者治疗后单核细胞亚群的表达变化(
±s)
革兰阴性杆菌感染患者治疗后单核细胞亚群的表达变化(±s)
| 单核细胞亚群 | 例数 | 治疗前 | 治疗3 d | 治疗7 d |
|---|---|---|---|---|
| 1型 | 10 | 82.9±4.2 | 80.2±5.3 | 76.8±4.1a |
| 2型 | 10 | 7.6±2.0 | 4.5±1.7a | 4.1±1.4a |
| 3型 | 10 | 3.7±3.1 | 8.5±2.9a | 12.9±3.8a |
| F值 | － | 5.673 | 18.578 | 41.046 |
| P值 | － | <0.05 | <0.01 | <0.01 |
注："－"．无相关数据；a与治疗前相比，P<0.05
外周血单核细胞可分为Mon1、Mon2和Mon3三个亚群，它们的功能各不相同，其中Mon1具有吞噬、蛋白水解及促炎作用，还能分泌促炎因子及黏附分子，能向发挥促炎作用的M1型巨噬细胞分化，发挥免疫清除功能[3,4]。Mon2主要分泌IL－10、血红素氧合酶(HO)－1免疫调节因子，具有抗炎和免疫调节作用，向具有抗炎作用的M2巨噬细胞分化[5,6]。在炎症刺激下，Mon2上的CD163被刺激并脱落，在CD163脱落的过程中伴随着Mon2向Mon1转化，且只有Mon2向Mon1转化的潜能，而不像巨噬细胞一样具有相互转化的能力[7]。Mon3在正常组织内皮细胞表面贴壁爬行，与血管内皮的损伤修复相关。
外周血单核细胞不同亚群对炎症的应答能力具有差异，Mon1激活NF－κB的信号通路的活性显著高于Mon2和Mon3，而Mon1和Mon2的吞噬活性相似，均显著高于Mon3，这种激活能力的不同导致了单核细胞亚群在不同病原体感染中的变化不同[8]。在类球孢子菌病患者中外周血Mon1、Mon2数量显著升高，治疗后Mon1水平很快降到基线水平，而Mon2水平仍维持在较高水平[9]。在利什曼原虫感染早期患者外周血CD16＋细胞(包括Mon2和Mon3)百分比显著升高[10]。登革热病毒感染早期Mon2细胞显著升高[11]。我们对革兰阴性杆菌感染有研究显示，与健康对照组比较，革兰阴性杆菌感染患者单核细胞计数和百分比均显著升高，Mon1细胞、Mon2细胞数量均显著升高，且Mon1、Mon2与WBC、CRP水平、MCP－1、IL－6呈显著正相关。分析原因可能是革兰阴性杆菌主要致病物质是内毒素LPS，而Mon1和Mon2表面强表达LPS的受体(CD4＋＋)，而Mon3表面的CD14分子表达弱于Mon1和Mon2。在革兰阴性杆菌感染后，更多的是激活Mon1和Mon2，从而使机体Mon1和Mon2代偿性升高，来应答抑制革兰阴性杆菌感染，提示单核细胞Mon1、Mon2在革兰阴性杆菌感染的发病机制中起重要作用。通过抗感染治疗后，Mon1和Mon2百分比显著下降，其中在治疗7 d后Mon1显著下降，而Mon2在治疗3 d后即显著下降，其原因可能是：Mon1对炎症的应答强于Mon2，在治疗后部分革兰阴性杆菌死亡后释放的内毒素LPS，仍能激活Mon1，而Mon2对炎症应答能力较弱，在革兰阴性杆菌治疗早期即反应性的下降；另一个原因可能是，Mon2在单核细胞亚群中百分比较低(革兰阴性杆菌感染者约7%左右)，较少的变化即可导致差异有统计学意义，而Mon1在单核细胞中所占的比例较高(革兰阴性杆菌感染者约83%左右)，需要较大的数值变化才能导致差异有统计学意义。Mon3百分比显著上升，一个重要的原因可能是因为Mon1、Mon2百分比下降所致。
综上所述，单核细胞Mon1、Mon2在革兰阴性杆菌感染中可能发挥重要作用，但单核细胞不同亚群的检测是否可以作为革兰阴性杆菌感染患者病情评估、进展及预后的判断，尚有待一步研究。
