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黏质沙雷菌是广泛存在于自然界的革兰阴性杆菌，具有极强的环境适应能力，存在于健康人的皮肤、肠道和呼吸道中，是临床常见的条件致病菌，可引起临床多种感染，当机体免疫力低下时可引起人体局部化脓性炎症和全身性感染，重症感染常危及患者的生命。近年来，该菌的临床分离率不断增加，成为医院尤其是重症监护病房(ICU)院内感染的重要条件致病菌之一[1,2]。由于广谱抗菌药物的广泛使用，黏质沙雷菌的感染日益增多，耐药性不断增强，尤其是出现了对碳青霉烯类抗菌药物耐药的黏质沙雷菌，给临床治疗带来了极大的困难[3]。本研究对南京医科大学附属苏州市立医院北区分离的耐碳青霉烯类黏质沙雷菌进行了相关耐药机制的调查分析，为临床治疗和医院感染的监控提供实验依据。
连续收集南京医科大学附属苏州市立医院北区2013年9月至2014年11月对亚胺培南、美罗培南均耐药的黏质沙雷菌16株，分别分离自痰液8株，伤口分泌物5株，血液3株；菌株来源科室分布为：烫伤科14株、ICU 2株。
使用法国生物梅里埃公司ATB Expression细菌鉴定仪对菌株进行鉴定，bioMerieux Vitek colorimeter测其吸光度。药敏纸片：阿米卡星、氨曲南、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、四环素、环丙沙星、庆大霉素、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南及M–H干粉培养基均购自英国Oxoid公司。PCR试剂、DNA Ladder购自Fermentas公司。
采用Kirby–Bauer纸片(K–B)琼脂扩散法测定抗菌药物对菌株抑菌圈的直径。结果按美国临床和实验室标准化协会(CLSI)标准判断敏感、中介或耐药[4]。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
从血平皿上沾取适量细菌，均匀悬浊于TE中，用bioMerieux Vitek colorimeter测其吸光度(A)值并调整至3.1～3.6。取240 μL细菌悬浊液于相应的1.5 mL Eppendorf管中，加入60 μL溶菌酶溶液，置于37 ℃水浴中孵育10 min。配制细胞裂解液时每5 mL加入37.5 μL蛋白酶K，然后颠倒混匀。选用Xbal(50 U)酶切，37 ℃水浴中孵育至少2 h。电泳预设温度在14 ℃，电泳参数为：初始脉冲时间2.2 s，终止脉冲时间63.8 s，电泳时间21 h。GoldView1型核酸染色剂染色，图像用GelDoc XR采集。
采用煮沸法提取细菌DNA。聚合酶链反应(PCR)扩增KPC、SHV、IMP、VIM和NDM–1基因，引物及反应条件参考文献[5]；扩增TEM和CTX–M基因，引物及反应条件参考文献[6]。耐药基因阳性对照来自本室保存的携带相应基因的肺炎克雷伯菌。
PCR扩增2个重要的外膜蛋白ompF、ompC基因，ompF上游引物序列F：5'–CCGAATAA CACCAATGAG–3'，下游引物序列R：5'–AAAAAATGATGGG GAAGG–3'，扩增产物1 272 bp；ompC上游引物序列F：5'–CAGTCGTGCTAATAATGC–3'，下游引物序列R：5'–AGTTC CATAATAGCCTCC–3'，扩增产物1 356 bp。PCR反应体系：95℃预变性10 min；然后变性95℃30 s，退火温度分别为54℃和56℃，退火时间均为30 s，72℃延伸30 s，30个循环；最后再72℃延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView1型核酸染色剂染色，紫外灯下观察结果，并将目的片段大小一致阳性样本PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进一步测序验证，所测序列与GenBank中Blast程序的序列作比对。
16株耐亚胺培南和美罗培南的黏质沙雷菌均表现为多重耐药，其对第三、四代头孢菌素等多种β–内酰胺类抗菌药物的耐药率较高，对氨曲南、头孢噻肟、哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率均达100%(表1)。
16株耐美罗培南和亚胺培南黏质沙雷菌耐药情况(株)
16株耐美罗培南和亚胺培南黏质沙雷菌耐药情况(株)
| 抗菌药物 | 耐药 | 中介 | 敏感 |
|---|---|---|---|
| 阿米卡星 | 12 | 2 | 2 |
| 氨曲南 | 16 | 0 | 0 |
| 头孢吡肟 | 15 | 0 | 1 |
| 头孢哌酮/舒巴坦 | 14 | 2 | 0 |
| 头孢噻肟 | 16 | 0 | 0 |
| 头孢他啶 | 13 | 2 | 1 |
| 哌拉西林 | 16 | 0 | 0 |
| 四环素 | 12 | 2 | 2 |
| 环丙沙星 | 14 | 2 | 0 |
| 庆大霉素 | 15 | 1 | 0 |
| 哌拉西林/他唑巴坦 | 16 | 0 | 0 |
| 氨苄西林/舒巴坦 | 15 | 1 | 0 |
| 左氧氟沙星 | 15 | 0 | 1 |
| 亚胺培南 | 16 | 0 | 0 |
| 美罗培南 | 16 | 0 | 0 |
16株耐碳青霉烯类黏质沙雷菌PFGE谱型可初步判断属于2个不同谱型，其中两株(6号和8号)为同一谱型，均来自ICU病区；另14株为同一谱型，均来自烫伤科病区，结果见图1。
注：M．标准带，1～16.酶切后菌株DNA，6、8.同一谱型；其他为同一谱型
16株耐美罗培南和亚胺培南的黏质沙雷菌均检测到耐药基因，CTX–M基因阳性14株，KPC基因阳性2株(6、8号菌株)。CTX–M和KPC扩增条带与目的片段一致，分别为548和448bp(图2)。二种阳性耐药基因经测序比对，一致性为100%，KPC为KPC–2型，CTX–M为CXT–M–1型。
注：M．标准带；1、4.肺炎克雷伯菌；2、3.CTX–M基因；5、6.KPC基因．
黏质沙雷菌属于沙雷菌属，广泛存在于环境中，近年来已成为国内外医院感染重要的条件致病菌，它可引起伤口、下呼吸道感染甚至菌血症，多发生于机体抵抗力低下、免疫功能不全、慢性疾病体弱患者[7,8]。本研究中，16株耐碳青霉烯类药物的黏质沙雷菌主要来自烫伤科和ICU，样本来源为痰液、伤口、血液，说明黏质沙雷菌在我院患者中主要引起呼吸道感染和创口感染，也是血行感染的病原菌。
本研究中黏质沙雷菌均为多重耐药株，该菌的耐药机制比较复杂，产超广谱β–内酰胺酶和诱导型β–内酰胺酶可能是对β–内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制 [9]，而对氨基糖苷类药物耐药主要是由于细菌产生氨基糖苷类修饰酶，对进入细胞的药物分子进行修饰使之失去生物活性而耐药[10]。碳青霉烯类药物是抗菌活性最强，抗菌谱最广的非典型β–内酰胺抗菌药物，因其具有对β–内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物的敏感性较高，但随着该类药物在临床的不规范使用，有关耐碳青霉烯类肠杆科细菌的报道逐年增多 [11,12]，但目前对耐碳青霉烯类药物的黏质沙雷菌的报道仍然较少见，国外对其耐药报道主要由于碳青霉烯酶SME介导 [13]，最近也有报道与外膜蛋白结构改变有关[14]。本研究收集的16株黏质沙雷菌对所测试的β–内酰胺类及氨基糖苷类药物均广泛耐药，其中2株扩增到KPC基因，其余14株扩增到CTX–M基因，进一步研究发现14株CTX–M基因阳性菌株的ompF基因第190位碱基G缺失，导致ompF基因移码突变。PFGE分析显示，2株KPC基因阳性菌株为相同谱型，来自ICU病区；另14株CTX–M基因阳性菌株为相同谱型，均来自于我院烫伤科病区。综合以上检出结果，推测我院黏质沙雷菌耐碳青霉烯类抗菌药物的机制主要为携带CTX–M基因及外膜蛋白基因ompF的移码突变，另外少部分菌株为携带KPC基因质粒。
条件致病菌大量繁殖和多重耐药菌株的产生主要由于广谱抗菌药物的使用或联合应用抗菌药物。本研究中16株耐碳青霉烯类的黏质沙雷菌均来自我院烫伤科收治的烫伤患者和ICU重症患者，这些患者必须使用大量抗菌药物进行快速有效的治疗，因而在长期碳青霉烯类抗菌药物作用压力下，产生了耐受碳青霉烯类药物的菌株，主要以携带CTX–M基因及外膜蛋白突变菌株为主，也有部分菌株携带KPC–2基因的耐药性质粒。CTX–M型酶是一类新型的非TEM、非SHV型超广谱β–内酰胺酶，首次在大肠埃希菌中被发现并命名，即CTX–M–1，由于这类酶对头孢噻肟的水解能力明显强于头孢他啶，因而被命名为头孢噻肟酶。目前，CTXM型超广谱β–内酰胺酶在国内也有较多流行的报道[15]。KPC酶全称为肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniae carbapenemase)，属A类β–内酰胺酶，目前能产KPC型碳青霉烯酶的细菌已从肺炎克雷伯菌扩大到大肠埃希菌、不动杆菌、黏质沙雷菌等细菌[16]。外膜蛋白是药物进入细菌与相应靶位点结合的特有通道，外膜蛋白发生缺失，或数量、结构改变可影响药物进入菌体内从而导致细菌产生耐药，其中OmpF蛋白是最重要的外膜蛋白之一。本研究中14株CTX–M基因阳性菌株的外膜蛋白基因ompF与KPC基因阳性菌株及其他敏感株相比，第190位碱基G有缺失，推测导致ompF基因移码突变，携带CTX–M基因联合ompF基因突变为本院黏质沙雷菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药最主要的机制，这类菌株占87.5%(14/16)，国内目前尚未见报道。另有2株KPC阳性与以往报道一致[17]。
本研究结果使我们对黏质沙雷菌耐碳青霉烯类抗菌药物的机制有了进一步的认识，提示为有效防止黏质沙雷菌耐药性的产生和播散，临床医师应慎用广谱特别是超广谱抗菌药物，积极采取措施，及时掌握细菌的流行和耐药情况，以药敏结果为指导，合理选用抗菌药物；同时提示医院应加强环境监测，保持病房空气新鲜、流通，防止患者之间的交叉感染；加强医疗器械的消毒管理、无菌物品的使用；微生物实验室也应加强与临床的沟通，及时有效地发放细菌鉴定及药敏报告，为临床提供抗感染治疗依据，从而有效控制院内感染及多重耐药细菌的发生。
