通过比较肺炎链球菌不同克隆株(国际流行克隆和上海本土克隆)在有无抗菌药物选择压力下适应性差别，分析其流行的原因并推测今后可能的优势克隆。
选取Taiwan19F－14克隆ST320及ST271各1株，上海本土克隆1株，均为青霉素不敏感菌株，通过体外PK/PD模拟口服阿莫西林500 mg，1次/8 h和1 000 mg，1次/8 h给药方案并绘制动态杀菌曲线，以ABBC0－24 h与AAC0－24 h的差值比较不加药情况下菌株的适应性，通过细菌清除速率常数(Ke)和AAC0－24 h分析在阿莫西林选择压力下肺炎链球菌的适应性差异。
无抗菌药物选择压力下肺炎链球菌适应性为ST320[83.2(logCFU/mL)·h]>ST2971[45.3(logCFU/mL)·h]>ST271[27.7(logCFU/mL)·h]，500 mg，1次/8 h给药下ST2971菌株未被清除，而ST320的Ke(0.0677/h)<ST271(0.1170/h)；1 000 mg，1次/8 h给药Ke值为ST2971(0.0418/h)<ST320(0.0872/h)<ST271(0.0890/h)；3株菌株在两种给药方式下AAC0－24 h值为ST2971<ST320<ST271。
药物选择压力下，上海本土克隆株的适应性好于Taiwan19F－14克隆，有可能获得传播优势，今后应对其密切监控。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
肺炎链球菌是肺炎、中耳炎、脑膜炎、血流感染的常见病原菌，据估算，全球每年肺炎链球菌感染约1450万例次，其中中国约170万例次[1]。上海市肺炎链球菌肺炎和脑膜炎的住院均次总费用在肺炎和脑膜炎治疗费用中均超过50%[2]。细菌耐药的出现和传播是一个复杂的生物学过程，常需要付出适应性代价，导致细菌生长速度、定植能力和毒力等降低，比较适应性差异可以分析某些耐药克隆获得传播优势的原因及抗菌药物在这一过程中所起的作用。Taiwan19F－14克隆等国际流行克隆的传播在上海临床分离肺炎链球菌耐药性发生和上升中起重要作用[3,4]。本研究采用体外药代动力学(Pharmacokinetics，PK)和药效动力学(Pharmacodynamics，PD)模型(PK/PD)模拟口服阿莫西林500 mg，1次/8 h和1 000 mg，1次/8 h两种给药方案，以细菌生长速度为适应性评价指标，比较国际流行克隆和上海本土克隆在无抗菌药物和阿莫西林两种给药方案下适应性差别，分析其流行的原因并推测今后可能的优势克隆。
选取Taiwan19F－14克隆ST320及ST271各1株，上海本土克隆ST2971 1株，均为青霉素不敏感菌株(PNSSP)，3株菌株来自2011年华山医院抗生素研究所微生物室保存的PNSSP(MIC>2 μg/mL)，分离自临床痰液样本，符合美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2011年药敏判断标准：MIC≤2 μg/mL为敏感，4 μg/mL为中介，≥8 μg/mL为耐药。采用多位点序列分型(MLST)网站提供的引物序列[5]，利用PCR方法进行MLST分型鉴定，在线比对MLST分型，eBURST进行同源性分析，参照肺炎链球菌分子流行病学网络确定国际流行克隆[6]，属于不同序列型的PNSSP 3株。青霉素对ST320、ST271和ST2971 MIC值分别为3、4和4 μg/mL，阿莫西林分别为4、4和8 μg/mL。
哥伦比亚血琼脂培养基(Oxoid)，Todd Hewitt肉汤(BD)，酵母粉(Oxoid)；Takara Taq、dNTP Mixture[TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司]；氨苄西林及阿莫西林标准品(中国药品生物制品检定所)。
体外PK/PD模型设备(主要Masterflex L/S蠕动泵、WinLIN V3.2软件)，Waters Alliance 2690型系列高效液相色谱仪，Finnigan TSQ Quantum Discovery Max型质谱仪，SS420X模数转换器，FinniganXcalibur(1.2版)数据处理系统。
建立PK/PD(口服一房室模型)，分别模拟口服阿莫西林500 mg，1次/8 h和1 000 mg，1次/8 h两种给药方案。阿莫西林500～3 000 mg为非线性关系，参考中国人群人体药动学500 mg[7]及本所1 000 mg单剂口服数据，中央室液体量100 mL，吸收室内液体量及泵流速按照如下公式计算[8]：Ka＝F/Va；K＝F/Vc (Va为吸收室内液体量，Vc为中央室内液体量，Ka为吸收速率常数，K为消除速率常数，F为泵流速)，吸收室液体量及流速见表1。将试验菌株接种于哥伦比亚血平板，5%CO2培养箱35℃过夜培养，取单个菌落于THB－Y中35℃摇床增菌到0.5麦氏浊度，选用含0.5%酵母提取物的Todd－Hewitt肉汤(THB－Y)作为培养基[9]，预热无菌THB－Y灌注体外模型设备，取0.5麦氏浊度的菌液0.1 mL接种至中央室并启动搅拌器，35℃培养箱培养2 h，此时菌液量约为106 CFU/mL，将预先稀释的药物加入吸收室并开启蠕动泵，此时为T0，含药培养基流入中央室，形成口服阿莫西林的吸收过程，加入的药量见表1，每8小时加入等剂量阿莫西林于吸收室内，模拟1次/8 h口服药物过程。采用LC－MS－MS方法[10]测定THB－Y中阿莫西林药物浓度。每次加药后自中央室采样进行菌落计数，绘制动态药物浓度作用下的杀菌曲线，评价Taiwan19F－14国际流行克隆ST320、ST271菌株和上海本土克隆ST2971菌株的适应性。ABBC为给药组杀菌曲线与对照生长曲线的夹闭面积，AAC为杀菌曲线与CFU初值水平线的夹闭面积，曲线下面积通过梯形法计算[11,12]，ABBC0－24 h与AAC0－24 h的差值可以反映不加药情况下菌株的生长能力，用于评价无抗生素选择压力下的适应性，差值越大，生长能力越强，适应性越强；细菌清除速率常数(Ke)和AAC两个药效学指标用于有抗生素选择压力下适应性评价，相同的药物浓度作用下，细菌清除速率越慢，菌株的适应性越好，AAC0－24 h值越大，药效越强，适应性越差。
体外模拟参数设置
体外模拟参数设置
| 给药方案 | F(mL/min) | Va(mL) | Vc(mL) | 摄入量(mg) |
|---|---|---|---|---|
| 1 000 mg 1次/8 h | 1.146 | 62.777 | 100 | 2.193 |
| 500 mg 1次/8 h | 1.065 | 53.517 | 100 | 1.416 |
注：F.泵流速；Va.吸收室内液体量；Vc.中央室内液体量
体外PK/PD模型显示，给药剂量药物浓度变化与口服阿莫西林相同剂量后体内变化一致，模拟效果见图1。
Taiwan19F－14国际流行克隆ST320、ST271菌株和上海本土克隆ST2971菌株ABBC0－24 h与AAC0－24 h差值分别为83.2、27.7和45.3(logCFU/mL)· h，可见适应性ST320>ST2971>ST271，ST320适应性最强，ST271最弱。
1 000 mg，1次/8 h下Ke显示，ST2971<ST320<ST271，500 mg，1次/8 h给药下ST320<ST271，上海本土克隆ST2971未被清除，菌落计数有增长。两种给药方式3株菌株的AAC0－24 h值比较结果是：ST271>ST320>ST2971，ST2971适应性最强，ST271最弱(表2)。
阿莫西林选择压力下3株青霉素不敏感肺炎链球菌适应性分析
阿莫西林选择压力下3株青霉素不敏感肺炎链球菌适应性分析
| 指标 | 500 mg 1次/8 h | 1 000 mg 1次/8 h | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Taiwan19F－14 ST320 | Taiwan19F－14 ST271 | 上海本土克隆ST2971 | Taiwan19F－14 ST320 | Taiwan19F－14 ST271 | 上海本土克隆ST2971 | |
| Ke(1/h) | 0.0677 | 0.117 | － | 0.0872 | 0.0890 | 0.0418 |
| AAC0－24 h(logCFU/mL)·h | －15.7 | 7.4 | －36.3 | 19.3 | 21.4 | －9.90 |
注： "－" ．未被清除；Ke: 细菌清除速率常数Ke＝[ln(Nt 1)－ln(Nt2)]/(T2－T1 )[13]
500 mg，1次/8 h给药3株菌株的T>MIC均<30%，1 000 mg，1次/8 h给药方案ST320和ST271菌株的阿莫西林T>MIC达到或接近40%(表3)。
阿莫西林两种给药方案对3株菌株的T>MIC数值表
阿莫西林两种给药方案对3株菌株的T>MIC数值表
| 给药方案 | 菌株序列型 | MIC(μg/mL) | T>MIC(%) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 青霉素 | 阿莫西林 | 0～8 h | 0～16 h | 0～24 h | ||
| 500 mg，1次/8 h | ST320 | 3 | 4 | 25.4 | 27.6 | 27.8 |
| ST271 | 4 | 4 | 28.3 | 28.6 | 27.7 | |
| ST2971 | 4 | 8 | 0 | 0 | 0 | |
| 1 000 mg，1次/8 h | ST320 | 3 | 4 | 38.9 | 40.0 | 38.8 |
| ST271 | 4 | 4 | 39.7 | 39.1 | 39.1 | |
| ST2971 | 4 | 8 | 12.8 | 14.1 | 14.9 | |
既往研究显示，国际流行克隆在PNSSP中占主导地位，并以Taiwan19F－14国际流行克隆居首位[3,4]。本研究选取3株PNSSP，ST320及其单位点突变体ST271属于Taiwan19F－14国际流行克隆，ST2971是本所首次报道的菌株，试验筛查时发现该序列及其ddl突变序列均来自上海，因此将该克隆称为上海本土克隆。
对2004至2005年菌株的研究[3]显示，ST271菌株远多于ST320，而2013年研究报道[4]，ST320菌株比例达到11.2%，ST320和ST271菌株所占比例差距在缩小，说明上海地区ST320菌株与其他亚洲国家类似，也有增多趋势。本研究显示，无论在无抗菌药物选择压力还是在阿莫西林选择压力下，ST320的适应性均优于ST271，这可能是ST320增多的原因之一。无抗菌药物选择压力下，肺炎链球菌适应性ST320>ST2971>ST271，ST320适应性最强，其次是ST2971。阿莫西林选择压力下，两种给药方式3株菌株的AAC0－24 h值比较结果是：ST271>ST320>ST2971，ST2971适应性最强，ST271最差，但是耐药菌株的克隆传播、适应性、药物选择性压力、肺炎链球菌疫苗推广后的免疫压力等多因素之间存在较复杂的相互影响，并且药物选择性压力与细菌耐药性关系复杂多变，与药物种类、给药方案等多种因素相关，具体影响仍需进一步探索。
阿莫西林是门诊，尤其是儿科治疗肺炎链球菌感染的常用药物，所以选用阿莫西林作为肺炎链球菌选择压力下适应性评价用药。阿莫西林口服吸收好，人体内代谢符合一房室模型[7]，本研究模拟的血药浓度变化与体内药动学变化基本一致，表明建立的模型能很好模拟两种给药方案在体内的药动学过程。阿莫西林口服500 mg，1次/8 h时3株细菌的T>MIC均<30%；1 000 mg，1次/8 h Taiwan19F－14克隆2株细菌的T>MIC可接近40%，但上海本土克隆(ST2971)菌株仍<20%。曾有动物实验研究报道，用青霉素或头孢菌素类药物治疗感染动物，T>MIC≤20%时，动物死亡率将近100%，当T>MIC≥40%～50%时，生存率可达到90%～100%[14]。因此，为抑制Taiwan19F－14克隆传播，阿莫西林应采取1 000 mg，1次/8 h给药方案。
在阿莫西林两种口服给药方案的选择压力下，上海本土克隆适应性优于2个常见国际流行克隆，提示该克隆增多可能是阿莫西林等抗菌药物选择压力的结果。本次筛选菌株分离自儿童，其青霉素MIC值高，PK/PD参数提示即使以阿莫西林高剂量(1 000 mg，1次/8 h)口服给药临床疗效亦差，鉴于儿童抗菌药物选择范围较小，在抗菌药物选择压力下极可能获得传播优势。今后应进行连续的分子流行病学监测，警惕其成为优势流行克隆而推高肺炎链球菌耐药水平。
本研究利用PK/PD体外模型评价了肺炎链球菌不同克隆菌株在生长方面的适应性差异及阿莫西林不同给药方案对其影响，尝试从接近临床实践的角度研究抗菌药选择压力与细菌适应性的关系。虽然肺炎链球菌耐药性发生和传播不仅仅取决于生长速度，亦不止受一种药物影响，要全面评估和研究各种肺炎链球菌耐药克隆的适应性及流行趋势，尚需要在体外进行更多药物及给药方案的测试，并引入动物模型评价不同克隆定植能力和致病性的差别。但本研究为分析细菌耐药性传播趋势及影响因素提供一个新的视角和思路，可望用于对更多种类细菌耐药性传播趋势的研究。
利益冲突 无
