观察头孢呋辛酯对小鼠阴道微生态平衡的影响。
选取SPF级雌性小鼠20只，并随机分为实验组A，实验组B和对照组C，对照组D，每组5只。实验组A和实验组B均用头孢呋辛酯灌胃用溶液灌胃5 d，对照组C和对照组D均用0.9%生理盐水灌胃5 d。在停药后的第1天取实验组A和对照组C小鼠的阴道分泌物，在停药后的第5天取实验组B和对照组D小鼠的阴道分泌物，检测小鼠阴道pH值、乳杆菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属和链球菌属菌落数，并制作乳杆菌属扫描电镜样本，观察其超微结构。同时对小鼠阴道菌群密集度和菌种多样性进行检测。采用t检验和Z检验对数据进行分析。
停药第1天，与对照组C相比，实验组A小鼠阴道pH值升高(t＝2.675，P<0.05)，乳杆菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属菌落数明显降低(t＝－2.741、－13.501、－3.077和－2.598，P值均<0.05)；停药第5天，与对照组D相比，实验组B小鼠阴道pH值仍升高(t＝4.797，P<0.05)，乳杆菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属和链球菌属菌落数明显降低(t＝－3.737、－6.816、－16.079和－3.580，P值均<0.05)。实验组(A和B)小鼠阴道内乳杆菌属电镜下均可见乳杆菌细胞壁出现皱缩、破损及断裂、细胞碎片。与对照组(C和D)比较，实验组(A和B)小鼠阴道菌群密集度和菌种多样性均降低(Z＝－2.437和－2.297，P值均<0.05)。
头孢呋辛酯可致小鼠阴道pH值升高，破坏优势菌乳杆菌的细胞壁，降低阴道菌群多样性和密集度，从而干扰阴道微生态平衡。
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阴道微生态系统由多种细菌和微生物组成，是人体四大微生态系统之一，对维持女性身体健康有重要意义。乳杆菌作为阴道菌群中的优势菌，对维持黏膜自身稳定及免疫系统的平衡有一定的作用[1]。因女性特殊的生理特点，阴道微生态系统平衡易受到体内雌激素水平、阴道冲洗及抗生素、性生活等多种内、外因素的影响，导致阴道微生态失衡，诱发多种女性下生殖道感染性疾病[2]。近年来，随着抗生素的广泛使用，细菌的耐药性增强，特别是革兰阴性菌[3]，Matani等[4]研究表明，意大利妊娠期女性的阴道和直肠分泌物中细菌的耐药性有所增加，这将导致女性下生殖道感染性疾病的发病率，复发率不断攀升。对于妊娠期妇女来讲，阴道炎诱发胎膜早破，早产，新生儿败血症等疾病的风险增加，此外由于部分抗生素可能会降低机体的免疫功能[5]，而某些类型的阴道炎(如复发性外阴阴道假丝酵母菌病)也与宿主自身的免疫缺陷有关[6]，因此广谱抗生素对阴道菌群平衡的影响值得深入探讨。本实验以小鼠为研究对象，从阴道pH值，活菌计数，菌群密集度，菌种多样性以及乳杆菌的超微结构方面，观察广谱抗生素对阴道微生态平衡的影响。
选取SPF级雌性小鼠20只，体质量18～22 g，购于浙江中医药大学动物实验中心。头孢呋辛酯片(西力欣)购于浙江中医药大学附属二院门诊药房；LBS培养基，DHL培养基，PEES培养基，TATAC培养基以及精密pH试纸购于上海广锐生物科技有限公司；2.5%电镜专用戊二醛固定液购于上海笃玛生物科技有限公司；哥伦比亚血平板购于杭州怡丹生物技术有限公司，厌氧袋购于法国生物梅里埃公司(BioMerieux)。
日立SU800场发射扫描电镜，Hfsafe-1500TE生物安全柜，HF240培养箱。
雌性SPF级小鼠20只，随机分成实验组A、实验组B和对照组C、对照组D，每组5只。用等渗NaCl溶液配置浓度为50 mg/mL头孢呋辛酯灌胃用溶液。实验组A、实验组B用头孢呋辛酯灌胃用溶液0.2 mL灌胃，1次/d，连续5 d然后停药；在停药后的第1天及第5天分别取实验组A和实验组B小鼠阴道分泌物。对照组C、对照组D均每天用0.9%生理盐水0.2 mL灌胃一次，连续5 d后停药；在停药后的第1天和第5天分别取对照组C和对照组D的小鼠阴道分泌物。
停药后第1天和第5天检测4组小鼠阴道pH值变化情况，用自制小棉签取小鼠阴道分泌物，滴在精密pH试纸上，30 s后迅速与比色卡比色，并记录结果。
用微量加样器取50 μL等渗NaCl溶液，反复冲洗各组小鼠阴道8次，注意无菌操作，取30 μL的阴道冲洗液10倍系列稀释至10－6。在生物安全柜中将各系列稀释液均用微量加样器取30 μL滴于相应的选择性培养基上，每种选择性培养基设两个平行板，涂布棒涂布均匀。LBS培养基选择性培养乳杆菌；PEES培养基选择性培养葡萄球菌；TATAC培养基用于选择性培养链球菌；DHL培养基用于选择性培养肠杆菌。不同培养基采用不同的厌氧或需氧环境培养，LBS培养基在厌氧袋内37℃，培养72 h，DHL培养基在培养箱内37℃，培养24 h；PEES及TATAC培养基在培养箱内37℃，培养48 h。然后对实验组(A和B)和对照组(C和D)小鼠阴道分泌物中肠杆菌、葡萄球菌、乳杆菌、链球菌进行培养并活菌计数(CFU/mL)。
取阴道冲洗液，滚动均匀涂片烘干，革兰染色并在油镜下观察30个视野，观察细菌分布、排列来直接进行判断、分级。在油镜下观察，每个视野细菌平均数为1～9个定为1级，10～99个定为2级，100个及以上定为3级，无法计算定为4级[7]。
取阴道冲洗液，依哥伦比亚血平板培养基中菌落形态，涂片染色镜检，进行初步鉴定。依据种属进行分级。以培养细菌种属数1～3种定为1级，4～6种定为2级，7～10种定为3级，10种以上定为4级[7]。
制作乳杆菌电镜观察样本，通过扫描电镜观察实验组和对照组小鼠阴道乳杆菌的超微结构。
采用SPSS 17.0软件分析数据，采用GraphPad Prism 5软件作图，实验数据中计量资料以
±s表示，两组间比较采用t检验；等级资料以例数表示，组间比较采用秩和检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
停用头孢呋辛酯片第1天，实验组A小鼠阴道pH值(6.84±0.38)高于对照组C小鼠(6.36±0.11)(t＝2.675，P<0.05)；停药第5天，与对照组D小鼠阴道pH值(6.28±0.19)相比，实验组B小鼠阴道pH值(7.02±0.29)明显升高(t＝4.797，P<0.05)。实验组B小鼠阴道pH值高于实验组A，但差异无统计学意义(t＝－0.839，P>0.05)(图1)。
注：与对照组C比较，aP<0.05；与对照组D比较，bP<0.05
实验组A小鼠阴道分泌物中乳杆菌属，肠杆菌属、葡萄球菌属和链球菌属菌落数较对照组C明显减少(t＝－2.741、－13.501、－3.077和－2.598，P值均<0.05)；实验组B小鼠阴道分泌物中乳杆菌属，肠杆属、葡萄球菌属和链球菌属菌落数较对照组D明显减少(t＝－3.737、－6.816，－16.079和－3.580，P值均<0.05)；与实验组B相比，实验组A小鼠阴道分泌物中乳杆菌属较少，但差异无统计学意义(t＝0.197，P>0.05)(表1，图2)。
头孢呋辛酯对实验小鼠阴道常居菌群数量的影响(log CFU/mL，
±s)
头孢呋辛酯对实验小鼠阴道常居菌群数量的影响(log CFU/mL，±s)
| 菌群 | 停药后第1天 | 停药后第5天 | ||
|---|---|---|---|---|
| 实验组A | 对照组C | 实验组B | 对照组D | |
| 乳杆菌属 | 2.65±0.24 | 3.12±0.30 | 2.62±0.30 | 3.20±0.18 |
| 肠杆菌属 | 3.91±0.08 | 4.43±0.02 | 3.89±0.18 | 4.44±0.31 |
| 葡萄球菌属 | 4.58±0.55 | 5.36±0.16 | 3.88±0.20 | 5.40±0.64 |
| 链球菌属 | 2.99±0.10 | 3.27±0.22 | 2.73±0.28 | 3.25±0.17 |
注：与对照组C比较，aP<0.05；与对照组D比较，bP<0.05
取实验组(A和B)及对照组(C和D)小鼠阴道冲洗液，制作乳杆菌电镜样本。经漂洗、固定、干燥及喷金等步骤后在扫描电镜下观察，见对照组乳杆菌呈球棒状或杆状，细胞壁厚度均匀，饱满，外观完整。实验组乳杆菌细胞壁厚度不均，可见皱缩，破损，断裂及细胞碎片，见图3。
注：A．对照组：乳杆菌细胞壁完整，厚度均匀饱满，成棒状或长杆状；B．实验组：乳杆菌细胞壁皱缩，断裂及细胞碎片
实验组(A和B)小鼠阴道菌群密集度主要集中在2级，对照组(C和D)主要集中在3级，经秩和检验，差异有统计学意义(Z＝－2.437, P<0.05)；实验组(A和B)小鼠阴道菌种多样性主要集中在1级，对照组(C和D)主要集中在2级，两组差异有统计学意义(Z＝－2.297，P<0.05)(表2)。
头孢呋辛酯对实验小鼠阴道菌群密集度和菌种多样性的影响(只)
头孢呋辛酯对实验小鼠阴道菌群密集度和菌种多样性的影响(只)
| 组别 | 只数 | 菌群密集度 | 菌种多样性 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1级 | 2级 | 3级 | 1级 | 2级 | 3级 | ||
| 实验组 | 10 | 3 | 6 | 1 | 6 | 3 | 1 |
| 对照组 | 10 | 1 | 2 | 7 | 1 | 5 | 4 |
| Z值 | － | －2.437 | －2.297 | ||||
| P值 | － | <0.05 | <0.05 | ||||
注："－" ．无相关数据
阴道微生态系统是由多种细菌组成，根据细菌和宿主的关系，可以分为过路菌群和常居菌群两部分。过路菌群是由非致病菌或机会致病菌组成，通常是指来自肠道、尿道及口腔的菌群，如大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、假丝酵母菌和B群链球菌等。而常居菌群是由相对固定的微生物组成，如：乳杆菌、消化链球菌、棒状杆菌、解脲脲原体等[6]。它们之间相互制约、相互影响，有层次、有秩序地定植于阴道黏膜上皮，并随着人体生理状态、阴道局部环境的改变而不停地发生演变。只有当宿主免疫功能受损，常居菌群出现紊乱，妊娠，大量使用抗生素，或者侵入性操作时，阴道微生态平衡被破坏，过路菌才在体内定植，繁殖引起疾病。
抗生素能抑制细菌的生长曲线，影响阴道微生态系统组成和功能[8,9,10]，其作用机制主要包括：抑制细菌细胞壁的合成、改变胞浆膜的通透性、抑制蛋白质的合成和影响核酸和叶酸的代谢。本实验通过扫描电镜下观察乳杆菌超微结构，发现实验组乳杆菌的细胞壁出现皱缩，断裂以及细胞碎片；而研究表明乳杆菌具有粘附和穿透黏膜层的属性，而这种属性与其表面的脂磷壁酸，黏液结合蛋白，纤连蛋白结合蛋白和S-层蛋白等多个因子介导有关[11]，抗生素对细菌细胞壁的结构的破坏，必然影响乳杆菌在阴道黏膜的定植，使得阴道乳杆菌的活菌数量减少，本实验中实验组(A和B)乳杆菌活菌菌落数均低于对照组(C和D)计数，基本证实了这一点。乳杆菌作为阴道微生态的优势菌群，其通过代谢产物乳酸、过氧化氢、细菌素及类细菌素物质来维持阴道的酸性环境和抑制病原菌的侵袭[12]，实验组(A和B)小鼠阴道pH值均高于对照组(C和D)，也提示了抗生素可能在抑制乳杆菌定植的同时，导致乳杆菌，特别是具有分泌乳酸功能的乳杆菌的数量减少，进而使阴道pH值升高。这些变化会使局部微生态系统发生改变，而这种变化可能促进条件致病菌的生长，使宿主更易受到病原菌的感染[13]。
链球菌、肠杆菌和葡萄球菌是除乳杆菌外小鼠阴道内的常居菌群，经抗生素处理后，其在实验组(A和B)中菌落数均低于对照组(C和D)；同时与对照组相比，实验组小鼠阴道菌群密集度和多样性也降低。以上结果提示广谱抗生素能抑制包含乳杆菌在内的多种细菌，改变菌种的多样性及密集度，进而导致阴道微生态失衡。Ferrer等[14]研究表明：抗生素会降低细菌菌落的数量和多样性以及导致细菌功能多样性的缺失，这些将可能导致机体对侵入性病原菌定植的抵抗力下降，可见抗生素对机体的影响不是单一的，一旦阴道微生态平衡被打破，就可能容易诱发感染。
临床使用的广谱抗生素的半衰期虽然不长，但由于其被频繁地使用并进入环境，导致其形成"假持续"现象，进而对人体健康以及整个生态系统构成长期潜在危害[15]。本实验将实验组分为A和B，目的是排除"收集阴道冲洗液操作"这一干扰因素，以观察停药后一定时间内，小鼠阴道优势菌乳杆菌及阴道pH值能否恢复到用药前水平。结果发现实验组B小鼠阴道pH值、乳杆菌菌落数均高于实验组A(P>0.05)，虽然二者的差异无统计学意义，但不排除以下两个方面：一方面，停药后乳杆菌的数量虽然有所增加，但阴道pH值却没有降低反而升高；另一方面，广谱抗生素对小鼠阴道pH值以及乳杆菌的功能及数量的影响可能是持续性的，特别是乳杆菌的功能，短时间内可能无法自然恢复到正常状态。近年来，有学者研究表明外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者阴道内定植的乳杆菌数量与种类并未明显减少，但各种乳杆菌的构成比发生了明显变化，特别是惰性乳杆菌[16]，而不同种类乳杆菌的生物学功能并不相同。
本研究从形态学上明确了抗生素对阴道乳杆菌细胞壁的破坏形式；证实了抗生素不仅能抑制致病菌的生长，同样可以抑制阴道微生态系统中的常居菌群，特别是抑制优势菌乳杆菌在阴道黏膜上皮定植，降低阴道菌群密集度和菌种多样性，提高阴道pH值，干扰阴道微生态平衡。
利益冲突 无
