综述
人感染H7N9禽流感病毒的研究进展
中华临床感染病杂志, 2017,10(1) : 68-75. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2017.01.015
摘要

人感染H7N9禽流感是一种新型禽源性流感病毒,于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现,并短时间内在我国迅速蔓延,感染导致较高的发病率和病死率,引起人们的担忧和恐慌,并引发全球范围的广泛关注。对患者体内分离的H7N9病毒基因分析显示,该病毒与人类呼吸道上皮细胞的唾液酸α-2,6型受体的亲和力较高。目前,人感染H7N9禽流感病毒的散发病例仍时有报道,冬春季相对高发。该文就近年来国内外H7N9禽流感感染患者的临床特点、流行病学及病毒基因特征的研究进展做一综述,为人感染H7N9禽流感的有效防控提供科学依据。

引用本文: 孙海燕, 童海江, 崔大伟, 等.  人感染H7N9禽流感病毒的研究进展 [J] . 中华临床感染病杂志, 2017, 10(1) : 68-75. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2017.01.015.
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H7N9禽流感病毒属于正黏病毒科甲型流感病毒属。甲型流感病毒多发于禽类,一些亚型也可感染猪、马等哺乳动物及人类。以往感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7[1],其中感染H5N1的患者病情重,病死率高。2013年以前已经报道的人感染H7亚型的禽流感病毒有H7N2、H7N3和H7N7等[2,3,4,5],引起人呼吸道感染和结膜炎等症状。2013年3月在我国上海、安徽发现人感染H7N9禽流感病例[6],这是全球首次发现人感染H7N9禽流感病例,感染的病毒是由6个来自H9N2的内部蛋白基因(PB2、PB1、PA、NP、MP、NS)、H7血凝素基因(HA)和N9神经氨酸酶基因(NA)等流感病毒基因片段重配形成的一个新型毒株[6]

1 人感染H7N9禽流感病例临床特点
1.1 临床症状

人感染H7N9禽流感患者一般表现为流感样症状,如发热,咳嗽,少痰,可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速,表现为重症肺炎[7],体温大多持续在39℃以上,出现呼吸困难,可伴有咯血痰,可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。Wang等[8]比较H7N9和H5N1禽流感住院病例的症状和体征发现,H7N9病毒感染的患者较H5N1病毒感染患者更容易出现发烧,排痰性咳嗽,咳血等临床症状,不仅重症化比例高,且病死率也高。Li等[9]研究显示,137例确诊病例均住院治疗,125例(91%)出现肺炎或呼吸困难,共有47例(34%)死亡。任瑞琦等[10]的研究中433例确诊患者共报道163例死亡,病死率为37.6%。Cox等[11]对北美H1N1(2009)、H3N2和H7N9病毒进行风险评估时分别将其评定为低风险、中等风险和高风险。据报道,H1N1(2009)在北美的病死率<0.02%[12],H3N2的病死率为6.3%~7.5%[13,14],而H7N9的病死率高达到36%~39%[15,16]

1.2 实验室检查
1.2.1 血常规检查

H7N9感染患者白细胞计数一般不高或降低,重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少,并出现血小板降低。Chen等[17]研究中,4例患者均出现显著的淋巴细胞减少,白细胞计数正常或偏少,但随着病程发展中性粒细胞逐渐增多,4例病例中有3例出现血小板减少,死亡病例在存活时呈现出持久的淋巴细胞计数减少。Wang等[8]发现H7N9感染患者存在与H5N1患者相似的白细胞减少症、血小板减少症,这些明显不同于H1N1(2009)患者(P<0.01)。

1.2.2 血生化检查

H7N9感染患者多有天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和C反应蛋白(CRP)的升高。Chen等[17]研究的4例患者,AST、ALT、CK、LDH和CRP均有不同程度的浓度升高,死亡病例中指标异常更明显。Wang等[8]发现H7N9感染患者存在与H5N1感染患者相似的ALT、CK、LDH和CRP的升高,这些都明显不同于H1N1(2009)患者(P<0.005)。

1.2.3 凝血功能

研究报道[18],血浆D-二聚体水平与H7N9禽流感的严重程度与预后存在相关性,血浆D-二聚体水平越高,H7N9禽流感越严重,死亡率也越高。Chen等[17]所报道的4例病例均出现凝血异常,血浆D-二聚体浓度随病程发展大幅上升。

1.3 胸部影像学检查

H7N9感染者发生肺炎的患者肺内出现片状影像,重症患者病变进展迅速,呈双肺多发磨玻璃影及肺实变影像,可合并少量胸腔积液,发生急性呼吸窘迫综合征(ARDS)时,病变分布广泛[19]。黄海华[20]的研究中3例危重患者首次DR均为双肺节段性、局灶性随机分布的磨玻璃样渗出性病变。查灶迅速进展,出现典型肺实变及胸腔积液,临床症状消失后复查均遗留肺间质及小叶间隔增厚。

1.4 治疗

抗病毒治疗能改善症状并有效减少体内病毒的含量[21,22]。治疗的早晚与预后相关,若延迟用药可能会增加死亡风险[23]。抗病毒治疗药物主要有神经氨酸酶抑制剂和离子通道抑制剂两类。研究显示,H7N9病毒对神经氨酸酶抑制剂,如奥司他韦(达菲)、扎那米韦敏感[7],而对离子通道抑制剂耐药[24]。一些研究报道部分H7N9病毒已对奥司他韦和其他神经氨酸酶抑制剂药物产生抗药性[25,26,27],实验性抗病毒治疗仍处于研究阶段[28,29]。除了抗病毒治疗外,对多器官衰竭患者应建立起相应的支持治疗[30,31,32,33]。美国疾病预防控制中心(CDC)建议所有住院确诊病例及门诊疑似病例均需早期应用抗病毒药物[28],CDC同时还建议最近有接触过确诊H7N9病例的门诊患者也应接受抗病毒治疗。在使用神经氨酸酶抑制剂中,奥司他韦可用于所有年龄段人群,扎那米韦适用于成人或7岁以上的青少年[34],重症患者或无法口服者上述两种药物者可用帕拉米韦静脉注射。赵永坤等[35]应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统分别构建表达H7N9亚型流感病毒HA、NA及M1蛋白的病毒样颗粒制备抗原,免疫健康马匹,采用亲和层析的方法获得了安全、高效的马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白F(ab’)2,为人禽流感治疗用制剂的研发提供了参考。罗旋等[36]的研究显示,金银花-连翘药对能够通过分子间的协同效应有效防治H7N9流感病毒。M4(连翘酯苷A)和M22(亚油酸乙酯)可以作为流感病毒H7N9(包括两种突变型)的潜在抑制剂进行进一步研究开发。

2 人感染H7N9禽流感病例流行病学特征
2.1 流行季节

人感染H7N9禽流感疫情有较明显的季节分布特点,以冬春季节为主[9],任瑞琦等[10]的研究也显示冬春季是发病高峰,即每年的12月至次年3月,7至9月一般是发病的低谷,提醒我们在H7N9禽流感高发时期(冬春季),尽量少去人多拥挤、空气不流通的场所。

2.2 易感人群

人感染H7N9禽流感感染患者主要为老年人,且男性多于女性。Li等[9]的研究中,139例确诊患者年龄中位数为61岁,70%是男性。任瑞琦等[10]的研究显示,433例确诊病例的年龄为1~91岁(中位年龄58岁),其中46%(199例)病例的年龄>60岁,仅有5.6%(24例)病例年龄<15岁,另确诊病例中男性多于女性,性别比为2.3:1。Cowling等[37]研究发现,人感染H7N9禽流感病毒导致的疾病严重程度与年龄呈正相关,≥65岁人群感染发展为重症病例的概率比年轻人群高5.1倍,且71%的确诊病例是男性[38]。Gao等[23]对111例人感染H7N9禽流感病例分析结果显示,平均年龄为61岁,42.3%的患者年龄≥65岁。Wang等[8]比较123例H7N9禽流感病例、119例H5N1禽流感病例和3 486例H1N1(2009)病例发现,H7N9病毒感染患者的平均年龄比其他两组流感人群大(63岁,P<0.01),且患者大部分是男性(71%,P<0.02)。有研究显示,年长者更易感染H7N9禽流感病毒并易发展成重症,可能与暴露于家禽的概率高、免疫力下降及存在基础疾病等因素有关[39]

2.3 传染源

携带H7N9禽流感病毒的禽类或者被该病毒污染的环境是本次疫情的传染源,病毒除经呼吸道传播外,也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染。研究发现一半以上的病例有活禽接触史,Li等[9]收集病史发现131例患者中82%发病前有明确的禽类接触史。任瑞琦等[10]报告的433例中有357例(82%)在发病前2周有活禽相关暴露史。Han等[40]也发现湖州的12例人感染H7N9病例在发病前均有家禽或活禽市场接触史,并在患者接触过的家禽样本及相关活禽市场样本中检测出了H7N9禽流感病毒核酸。大量研究结果提示,活禽暴露是人感染H7N9禽流感病毒的关键风险因素,这些研究发现提醒我们在接触禽畜后应及时彻底清洗,生禽、畜肉和鸡蛋等一定要烧熟煮透,勿接触病、死的禽畜类。另外Yu等[41]在浙江省4例H7N9禽流感死亡患者的粪便中检出H7N9禽流感病毒,因此认为H7N9禽流感病毒也可能通过人类粪便进行传播。至于该病毒是否会出现人传人?从目前报道的病例资料看,绝大多数仍以散发为主,但基因序列分析显示H7N9病毒出现部分氨基酸位点的突变,使病毒不仅增加了与人类呼吸道上皮细胞唾液酸α-2,6型受体的亲和力[42],而且仍保留了对禽类上皮细胞唾液酸α-2,3型受体的结合力,由于病毒具有对两种受体的亲和力,使得病毒能继续有效地在禽类间传播,也能通过人禽接触感染人类的下呼吸道黏膜,而且我们的报道中也存在个别家庭聚集的病例,因此尚不能排除病毒存在人传人的可能[43]

2.4 既往疾病史

Wang等[8]通过调整年龄和性别后评估风险因素,显示慢性疾病史,尤其是冠心病和糖尿病是最常见的风险因素。由于冠心病好发于老年人,并且在中国,男性比女性普遍易患冠心病(男性患病率0.74%;女性患病率0.51%)[44],这可能部分解释了H7N9患者多为老年人的年龄分布特点,也部分解释了群体中男性患者较女性多的原因。有报道显示慢性基础性疾病史(包括COPD、糖尿病、高血压、肥胖症、慢性肺部和心脏疾病)是H7N9感染的潜在风险因素[45]。妊娠通常被认为是一个与流感发病率和死亡率相关的风险因素[46]

3 H7N9禽流感病毒基因特征

H7N9病毒是由6个来自H9N2的内部蛋白基因(PB2、PB1、PA、NP、MP、NS)、H7血凝素基因(HA)和N9神经氨酸酶基因(NA)等流感病毒基因片段重配形成的一个新型病毒[6]

3.1 重要氨基酸突变位点分析
3.1.1 HA蛋白

HA受体结合位点的变化与病毒的宿主特异性直接相关[47]。流感病毒HA至少存在10个受体结合关键氨基酸位点(N3 Numbering),包括G186V、E190D、Q192H/R、N224K、G225D、Q226L、S227N、G228S、A134V/T和A138S,其中Q226L最为重要[48]。这些突变均可增强病毒与人上呼吸道上皮细胞唾液酸α-2,6型受体的亲和力,使病毒能直接从禽类传播到人类,并在短时间内造成较大范围的传播。Gao等[6]研究结果发现在A/Anhui/1/2013和A/Shanghai/2/2013这两株均发生了Q226L和G186V的突变,而A/Shanghai/1/2013发生A138S的替换,另外一株A/Hangzhou/1/2013毒株在226处编码异亮氨酸(I),这个氨基酸通常出现在季节性流感中。HA的前体分子为HA0,在病毒成熟过程中,HA0分子要裂解成HAl和HA2两条多肽,病毒才具有感染性。不同亚型的禽流感病毒HA裂解位点的氨基酸组成不同,低致病性禽流感病毒的HA裂解位点只含1-2个碱性氨基酸,而高致病性禽流感病毒的HA裂解位点则至少含4个碱性氨基酸[49]。此次流行的H7N9禽流感病毒的HA裂解位点氨基酸序列为PEIPKGR↓GLF,仅含赖氨酸(K)和精氨酸(R)两个碱性氨基酸残基,显示尚未发生切割位点的改变,该毒株对禽类而言为低致病性禽流感病毒。另有报道称HA蛋白中A316S的变异与NA颈部氨基酸的缺失能增强HA的切割能力[50],使病毒对家禽和小鼠毒力增强。

3.1.2 NA蛋白

NA蛋白的酶活性位点氨基酸发生突变,特别是E120G、R153K、H276Y、R294K(N9 numbering)的变异[51],可能会导致流感病毒对神经氨酸酶抑制剂耐药性的改变[52]。病原学监测发现,一株分离自上海的H7N9禽流感病毒(A/Shanghai/l/2013)已发现R294K突变[53],此外,Hu等[21]报道,2例人感染H7N9禽流感确诊病例在接受抗病毒治疗一周后,病毒NA出现了R294K耐药性的突变,导致病毒滴度持续维持在高水平。基于个别毒株已出现了对神经氨酸抑制剂的耐药性突变,当前亟需加强对H7N9禽流感病毒的病原学监测,及时发现变异动向。NA颈部69-73位氨基酸的缺失有可能提高了病毒的复制能力[54],也可能提高了病毒对哺乳动物的毒性[55],还可能跟禽流感病毒对家禽的适应和传播有关[56],使禽流感病毒能够适应家禽。另外Chen等[57]研究2013年10月浙江绍兴分离株(A/Zhejiang/22/2013)时发现NA蛋白出现了以下新的突变:V241I、K266E、N327T、N346D、K465R,这些新突变的意义有待进一步研究。

3.1.3 PB2蛋白

许多人感染H7N9禽流感病毒分离株的PB2蛋白中会出现E627K的突变,有研究显示该突变的存在不仅能增强病毒在哺乳动物体内的复制能力和病毒传播的速度,还能使其在小鼠或其他哺乳动物体内毒力增强,同时增强哺乳动物对病毒的反应性[6,58,59]。另外PB2中G590S、Q591R、D701N、L714R、L89V、A44S变异的存在会导致禽流感病毒在小鼠中扩增能力增强[20]

3.1.4 PB1蛋白

陈寅等[60]对A/Zhejiang/HuZ1/2013(H7N9)病毒氨基酸突变分析显示在PB1蛋白发生了H99Y、I368V突变,这些位点的突变能增强小鼠的毒力。Chen等[61]在研究MHCI类分子递呈抗原肽时发现了一种不属于流感病毒任何已知开放阅读框(Open reading frame, ORF)编码的多肽——PB1-F2蛋白,研究显示[62],PBl-F2蛋白可以诱导宿主细胞线粒体途径的细胞凋亡,部分流感病毒毒株的PBl-F2蛋白可以提高流感病毒聚合酶活性,从而促进病毒在宿主细胞中的复制。完整的PB1-F2蛋白上存在特异性抗原表位,能诱导宿主体内T细胞的表达,引起其免疫水平的改变,这与二次细菌感染引发的肺损伤具有显著关联;还发现随着基因的进化,有部分甲型流感病毒的亚型在PBl-F2序列上提前出现了终止密码子,导致PBl-F2蛋白的断裂,形成PBl-F2长度的多态性。基于研究结果的猜想,截短型流感毒株易导致基因结构的不稳定,使毒株易于发生基因突变,进而利于病毒的复制与传播。美国病毒学家McCullers和研究小组通过研究[63]得出结论:PB1-F2会使流感病毒的破坏能力加强,他表示,虽然PB1-F2的具体作用机制还不清楚,但此蛋白可作为流感药物的潜在药靶,通过抑制它的功能可减少肺部损伤和并发炎症。另有研究[64]显示,PB1-F2中N66S突变可引起肺部疾病严重程度的增加及细胞因子产生的增多。

3.1.5 M2蛋白

M2蛋白是流感病毒另一种重要的膜蛋白,具有离子通道作用,其N端为跨膜区,是离子通道抑制剂金刚烷胺类药物作用靶点。如果M2蛋白跨膜区的氨基酸发生突变,则金刚烷胺不能与离子通道结合,从而产生耐药性。M2蛋白的耐药性突变位点主要是L26F、V27A、A30T、S31D和G34E,其中任何一个氨基酸位点发生突变,都可能会导致对离子通道抑制剂类药物产生耐药性[65]。目前研究报道的所有H7N9禽流感病毒分离株的M2蛋白均出现S31N突变,提示此次流行的H7N9禽流感病毒对金刚烷胺及金刚乙胺类离子通道抑制剂不敏感。

3.1.6 PA蛋白

研究报道中A36T、K353R变异与病毒毒力的增强有关[66],100A、356R、409N这些位点突变会导致禽流感病毒在哺乳动物扩增能力的增强[21]

3.1.7 其他片段蛋白

陈寅等[60]对A/Zhejiang/HuZ1/2013(H7N9)病毒氨基酸突变分析显示M1蛋白发生了N30D和T215A突变,这些位点的突变能增强小鼠的毒力。另有研究显示,NS1蛋白P42S、D92E的突变能增加小鼠的毒性[6],而NS1蛋白序列中"218-230缺失"则会导致病毒毒力的减弱。

3.2 潜在糖基化位点分析

糖基化位点对于流感病毒的致病性及宿主特异性均有重要意义。Gao等[6]发现H7N9禽流感病毒的HA含有5个保守的潜在糖基化位点,分别为30NGTK、46NATE、249NDTV、421NWTR、493NNTY;NA含有7个保守的潜在糖基化位点,分别为42NCSH、52NTSQ、63NETN、66NITN、82NLTK、142NGTI、197NASA。研究认为[67],糖基化对于病毒重要位点具有保护作用,能使病毒逃离宿主的免疫系统,位于HA蛋白切割位点附近的两个糖基化比较稳定,很少出现缺失,而病毒颈部位置附近的糖基化位点则较易缺失。糖基化在病毒的疫苗研制,宿主选择和毒力变异种起到重要作用。

4 H7N9疫苗

H7N9禽流感病毒为一种新型病毒,其抗原性与以往流行的禽流感病毒不同,因此,原有的季节性流感疫苗和禽流感疫苗对其缺乏免疫保护作用。针对H7N9禽流感病毒的特异性疫苗正在研制中,世界卫生组织(WHO)公布的八个H7N9禽流感候选疫苗病毒已经通过了有关安全测试和双向血细胞凝集试验,候选的疫苗株来自两个毒株:A/Shanghai/2/2013类似株和A/Anhui/1/2013类似株[68]。虽然在第三波H7N9流行中产生了一些基因序列变化,但迄今为止大多数H7N9菌株的抗原特征仍类似于A/Anhui/1/2013病毒株[16,69]。目前国内也有许多针对疫苗表位的研究,陶薇等[70]鉴定出4个HA蛋白线性B淋巴细胞抗原表位,其中第172~183和452~472区段具有更好的H7亚型特异性,可作为新型疫苗表位设计的依据。

5 小结与展望

人感染H7N9禽流感作为一种新发传染病已引起高度重视,国内外学术界在短时间内取得了令人瞩目的研究进展,但还有许多问题有待阐明及解决,如病毒是否会继续演化以适应人传人,人群对H7N9禽流感的免疫力如何,目前所研制的疫苗有效性如何等等,需要我们不断探索来解决。同时,快速增加的H7N9禽流感病例及病毒基因变异提醒我们应时刻保持高度警惕性,加强流感疫情的监测,及时跟踪病毒的变异变迁,随时做好应对大流行到来的防备工作。

利益冲突

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