收集2013年5月至2015年11月临床分离的非重复耐碳青霉烯肠杆菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)[亚胺培南最小抑菌浓度值(MIC)≥4 μg/mL]，共26株。其中肺炎克雷伯菌17株、大肠埃希菌5株、阴沟肠杆菌3株和产酸克雷伯菌1株，来自痰标本10株、尿液6株、血液5株、分泌物2株、导管1株、咽拭子1株和肛周拭子1株。试验所用菌株采用法国梅里埃公司的Vitek 2 Compact和MALDI-TOF MS(Bruker)进行菌种鉴定。质控菌株大肠埃希菌25922和肺炎克雷伯菌700603购自卫生部临床检验中心。

Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定仪、配套药敏卡AST-GN16(法国生物梅里埃公司)；MALDI-TOF MS质谱鉴定仪(Bruker)；PCR扩增仪(美国Perkin Elmer公司)；水平电泳仪(北京六一仪器厂)；Gel Doc XR＋凝胶成像系统仪(美国Bio-Rad公司)。所有引物由上海Sangon公司合成。

Vitek 2 Compact系统配套药敏卡对细菌进行药敏试验，操作和结果判读参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2016年标准执行。

采用煮沸法，挑取血平板上18～24 h培养后的新鲜菌落，将其放入盛有100 μL去离子水的1.5 mL EP管中，然后放入加热仪中，经100 ℃ 15 min后，12 000×g离心5 min，取上清液作为PCR扩增模板。

委托上海Sangon公司合成4对碳青霉烯酶基因引物，包括KPC、NDM、IMP、VIM，反应体系为25 μL，参数分别为：bla_KPC、bla_NDM 94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环后，72 ℃延伸10 min。bla_IMP、bla_VIM为96℃预变性5 min，96 ℃ 60 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30个循环后，72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 μL PCR产物经含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后凝胶置于Gel Doc XR＋凝胶成像仪中进行摄像，并保存图片^[4]。与标准条带相比，在预期位置出现的条带为阳性。

将PCR扩增阳性产物送上海Sangon公司进行测序。测得DNA序列利用NCBI网站(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blastn程序进行比对，确定基因型。

肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌7对管家基因引物序列参见参考文献^[5,6]，分别扩增肺炎克雷伯菌rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB和大肠埃希菌recA、adk、icd、fumC、mdh、purA、gyrB 7对管家基因，扩增产物送上海Sangon公司进行测序，测序结果上网(http: //bigsdb.pasteur.fr/index.html)比对后做MLST分析，确定菌株的ST型别。

26株CRE菌株基因检测结果显示，有18株bla_NDM基因阳性，9株bla_KPC基因阳性，bla_VIM、bla_IPM均为阴性。18株bla_NDM基因阳性菌株分别为肺炎克雷伯菌9株、大肠埃希菌5株、阴沟肠杆菌3株和产酸克雷伯菌1株，其中1株肺炎克雷伯菌同时携带bla_NDM和bla_KPC基因，予以剔除。9株bla_KPC基因阳性菌株均为肺炎克雷伯菌。将PCR阳性扩增产物委托上海Sangon公司进行纯化测序，测序结果提交到GenBank在线数据库进行比对，结果与bla_NDM-1和bla_KPC-2基因序列一致。

17株产NDM-1菌株药敏结果显示，对厄他培南、亚胺培南、头孢曲松、头孢吡肟和氨苄西林均耐药，其中亚胺培南MIC≥8 μg/mL。除1株肺炎克雷伯菌和1株大肠埃希菌对哌拉西林/他唑巴坦中介外，其他均耐药。除1株肺炎克雷伯菌对氨曲南中介及1株大肠埃希菌和1株产酸克雷伯菌对氨曲南敏感外，其余菌株对氨曲南均耐药。除1株大肠埃希菌对阿米卡星耐药及1株肺炎克雷伯菌对替加环素耐药外，其余菌株对阿米卡星、替加环素均敏感。3株肺炎克雷伯菌、2株大肠埃希菌和1株产酸克雷伯菌对庆大霉素敏感。1株肺炎克雷伯菌、2株大肠埃希菌和1株产酸克雷伯菌对妥布霉素敏感。4株肺炎克雷伯菌、1株阴沟肠杆菌和1株产酸克雷伯菌对环丙沙星敏感。5株肺炎克雷伯菌、1株阴沟肠杆菌和1株产酸克雷伯菌对左旋氧氟沙星敏感。2株肺炎克雷伯菌、1株大肠埃希菌、2株阴沟肠杆菌和1株产酸克雷伯菌对复方黄胺甲噁唑敏感。抗菌药物对NDM-1肠杆菌科细菌MIC见表1。

点击查看表格

表1

抗菌药物对产NDM-1肠杆菌科细菌的最小抑菌浓度(μg/mL)

表1

抗菌药物对产NDM-1肠杆菌科细菌的最小抑菌浓度(μg/mL)

菌株	ETP	IPM	CRO	FEP	ATM	TZP	AMK	GEN	TOB	CIP	LEV	AMP	SXT	TGC
KP1	≥8	≥16	≥64	≥64	≥64	≥128	≤ 2	≤ 1	8	2	1	≥32	≥320	1
KP2	≥8	≥16	≥64	≥64	≥64	≥128	≤ 2	≥16	≥16	≥4	≥8	≥32	40	2
KP3	≥8	≥16	≥64	16	≥64	≥128	≤ 2	≥16	8	0.5	1	≥32	≥320	2
KP4	≥8	≥16	≥64	32	8	64	≤ 2	≤ 1	8	1	1	≥32	≤ 20	1
KP5	≥8	≥16	≥64	16	≥64	≥128	≤ 2	≥16	8	≤0.25	1	≥32	≥320	2
KP6	≥8	≥16	≥64	≥64	≥64	≥128	≤ 2	≥16	2	1	1	≥32	≥320	≥8
KP7	≥8	≥16	≥64	≥64	32	≥128	≤ 2	≥16	≥16	≥4	≥8	≥32	≥320	2
KP8	≥8	≥16	≥64	16	≥64	≥128	≤ 2	≤ 1	8	≥4	≥8	≥32	≥320	2
EC1	≥8	8	≥64	≥64	≥64	≥128	4	2	≥16	≥4	≥8	≥32	≥320	≤0.5
EC2	≥8	≥16	≥64	≥64	≥64	≥128	≥64	≥16	≥16	≥4	≥8	≥32	≥320	≤0.5
EC3	≥8	≥16	≥64	≥64	≥64	≥128	≤ 2	≤ 1	≤ 1	≥4	≥8	≥32	≤ 20	≤0.5
EC4	≥8	8	≥64	16	4	64	≤ 2	≥16	4	≥4	≥8	≥32	≥320	≤0.5
EC5	≥8	8	≥64	≥64	≥64	≥128	≤ 2	≥16	8	≥4	4	≥32	≥320	2
ECL1	≥8	≥16	≥64	≥64	≥64	≥128	≤ 2	≥16	8	1	1	≥32	≥320	2
ECL2	≥8	≥16	≥64	≥64	≥64	≥128	≤ 2	≥16	8	≥4	≥8	≥32	≤ 20	2
ECL3	≥8	≥16	≥64	≥64	≥64	≥128	≤ 2	≥16	8	≥4	≥8	≥32	≤ 20	≤0.5
KO1	≥8	≥16	≥64	16	≤ 1	≥128	≤ 2	≤ 1	≤ 1	≤0.25	≤0.25	≥32	≤ 20	≤0.5

注：ETP.厄他培南；IPM.亚胺培南；CRO.头孢曲松；FEP.头孢吡肟；ATM.氨曲南；TZP.哌拉西林/他唑巴坦；AMK.阿米卡星；GEN.庆大霉素；TOB.妥布霉素；CIP.环丙沙星；LEV.左旋氧氟沙星；AMP.氨苄西林；SXT.复方磺胺甲噁唑；TGC.替加环素；KP.肺炎克雷伯菌；EC.大肠埃希菌；ECL.阴沟肠杆菌；KO.产酸克雷伯菌

17株产NDM-1肠杆菌科细菌分别来自17例患者，对17例病例进行回顾分析。5例患者(病例8、12、13、14和15)虽分离到产NDM-1细菌，均未入住ICU病房，无多脏器功能衰竭，未予抗生素治疗，给予相应对症支持治疗，如予肠内营养、降糖和降脂等，好转出院。病例2、7和10，患者均未入住ICU病房，无多脏器功能衰竭，无机械通气，给予抗生素积极治疗，好转出院。病例1和4为婴儿，病例1诊断为肺炎，入院8 d后分离到NDM-1菌株，使用抗生素治疗，8 d后好转出院；病例4也诊断为肺炎，在进入本院治疗24 h内分离到NDM-1菌株，进行抗菌治疗，12 d后好转出院。3例患者(病例3、5和11)曾入住ICU，分离菌株前有长时间住院史，伴有多种脏器功能衰竭，有机械通气，死亡原因与基础疾病有关，与产NDM-1细菌感染关系并不明确。病例6，患者高龄，伴有呼吸衰竭，肝、肾功能衰竭，高血压、冠心病和糖尿病等多种疾病，入住ICU 2 d后分离到NDM-1细菌，死亡原因仍与基础疾病有关。病例9，患者高龄，伴有肝功能损害、呼吸衰竭、肾功能衰竭、心力衰竭和糖尿病等多种疾病，未曾入住ICU病房，分离菌株前有长时间住院史，虽予抗生素积极治疗，无效死亡，死亡原因与基础疾病有关。病例16、17，患者主动要求出院，治疗结果不详。17例产NDM-1肠杆菌科细菌感染患者的临床资料见表2。

点击查看表格

表2

17例产NDM-1肠杆菌科细菌感染患者的临床特征

表2

17例产NDM-1肠杆菌科细菌感染患者的临床特征

病历号	性别	年龄(岁)	住院科室	临床诊断	标本来源	菌株	抗生素治疗	结局	MLST分型
1	女	2个月	儿科	肺炎	痰液	KP	TZP	存活	278
2	男	84	内科	肺炎	血液	KP	MEM＋CAZ	存活	726
3	男	93	老年科	多脏器功能不全	血液	KP	MEM＋TGC＋TZP＋TEC	死亡	35
4	男	4个月	儿科	肺炎	咽拭	KP	ERY＋AZT	存活	17
5	男	91	老年科	肺癌	痰液	KP	SCF＋TZP＋TEC	死亡	35
6	男	87	老年科	重症肺炎	痰液	KP	IMP＋CAZ	死亡	35
7	女	67	理疗科	脑出血	痰液	KP	MXF	存活	147
8	男	83	内科	慢性阻塞性肺疾病	痰液	KP	无	存活	726
				伴急性加重
9	男	80	内科	重症肺炎	痰液	EC	SCF＋TGC＋MNO	死亡	167
10	男	67	泌尿外科	膀胱尿路上皮癌	血液	EC	LEV	存活	167
11	男	61	重症科	脑脓肿	血液	EC	无	死亡	1 989
12	女	68	心胸外科	肺炎	尿液	EC	无	存活	315
13	女	68	理疗科	脑出血	尿液	EC	无	存活	167
14	男	78	理疗科	脑出血	尿液	ECL	无	存活	－
15	女	64	内科	脓毒症	尿液	ECL	无	存活	－
16	男	46	神经外科	急性颅脑损伤	痰液	ECL	MEM	NA	－
17	男	22	血液科	急性髓系白血病	血液	KO	TGC	NA	－

注："－".无相关数据；KP.肺炎克雷伯菌；EC.大肠埃希菌；ECL.阴沟肠杆菌；KO.产酸克雷伯菌；NA.非医嘱离院；TZP.哌拉西林/他唑巴坦；ERY.红霉素；AZT.氨曲南；CAZ.头孢他啶；MEM.美罗培南；IMP.亚胺培南；LEV.左氧氟沙星；TGC.替加环素；TEC.替考拉宁；MXF.莫西沙星；SCF.头孢哌酮/舒巴坦；MNO.米诺环素

17例携带NDM-1肠杆菌科细菌患者中，来源科室主要为内科、老年科和理疗科，临床诊断以肺炎为主。其中男性患者多于女性，男性12例，女性5例。年龄以60岁以上为主，占76%，平均年龄(62.29±29.16)岁。标本来源以痰液(41%)、血液(29%)和尿液(24%)为主。菌种分布以肺炎克雷伯菌所占比例最高(47%)，其次为大肠埃希菌(29%)、阴沟肠杆菌(18%)和产酸克雷伯菌(6%)。17例CRE患者中5例死亡，病死率为29%。对17株产NDM-1肠杆菌科细菌进行MLST分型分析，其中8株携带NDM-1肺炎克雷伯菌，MLST分型共有5种ST型，其中有3株为ST35型，2株为ST726型，1株为ST278型，1株为ST17型，1株为ST147型；5株携带NDM-1大肠埃希菌MLST分型共有3种ST型，其中有3株为ST167型，1株为ST315型，1株为ST1 989型。3株阴沟肠杆菌和1株产酸克雷伯菌未做分型，其中产酸克雷伯菌因无数据库而未进行分型。MLST分型结果见表2。