收集2013至2015年丽水市中心医院临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药的大肠埃希菌，－80℃保存菌种。

药敏试验M-H培养基和药敏纸片均购自英国Oxoid公司，包括氨苄西林、头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、头孢替坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南、厄他培南、庆大霉素、妥布霉素、复方磺胺甲恶唑、左氧氟沙星、阿米卡星、米诺环素及多黏菌素B。Vitek-2 Compact细菌鉴定仪购自法国梅里埃公司。

采用Vitek-2 Compact全自动微生物分析系统联合纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验，药敏结果按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2017年的标准判定^[1]。

引物设计参照文献[2]委托上海生物工程公司合成。反应体系(25 μL)：模板2 μL，上下游引物各1 μL，Hieff™ PCR MasterMix混合液12.5 μL，加水至25 μL。反应参数为：94℃预变性3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃1 min，循环35次，最后72℃延伸5 min。PCR产物进行1%凝胶电泳，120 V，30 min。电泳结果阳性的PCR产物送上海华津生物科技有限公司测序，结果在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行BLSAT分析。

热裂解法提取细菌DNA，选用存在于肠杆菌科细菌DNA中的重复序列ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′-AAG TAAGTGACTGGGGTGAGCG-3为引物进行扩增。反应体系(25 μL)：模板2 μL，上下游引物各1 μL，Hieff™ PCR MasterMix混合液12.5 μL，加水至25 μL。PCR扩增条件：94℃预热3 min，94℃变性45 s，45℃复性1 min，72℃延伸2 min，35次循环，最后延伸72℃ 8 min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中120 V电泳30 min，凝胶成像系统观察结果并拍照。PCR扩增条带数量及位置相同者为同一克隆群，主要条带位置相同，副条带相差1条的为亚型。否则为不同克隆群^[3]。

PCR扩增大肠埃希菌7个管家基因(adk、fumc、gyrb、icd、mdh、purA、recA)并测序，引物参考网站：(http//mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli)。测序结果网站上比对确定ST型(https：//pubmlst.org/bigsdb？db＝pubmlst_mlst_seqdef)。

受体菌为叠氮钠耐药的大肠埃希菌J53。供体菌和受体菌分别接种在5 mL LB肉汤培养基，37℃，200 rpm培养4 h；然后吸取100 μL供体菌、100 μL受体菌到含有4 mL新鲜LB肉汤培养基的EP管中，混合后置35℃孵箱过夜培养；第2天取100 μL接合后菌液均匀涂布于筛选平板(5 mg/L美罗培南＋100 mg/L叠氮钠)，35℃孵箱过夜培养；挑取单菌落转划筛选平板，35℃孵箱过夜培养。接合子质粒DNA扩增耐药基因，PCR产物进行1%凝胶电泳，阳性结果送上海华津生物科技有限公司测序，结果在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行BLSAT比对分析。

输入关键词"Carbapenenenes-producingEscherichia coli"，时间限定在2013年1月到2017年12月，在PubMed网站上共收集到289篇相关文章，剔除非临床及重复报道的菌株，共收集到全球27个地区70种MLST分型数据。将所有ST分型数据导入eBRUST V3软件分组分析，分组严格按照7个管家基因中6个及以上相同的归为一组，bootstrap参数设为1 000。采用非加权组平均法(UPMGA)在MAGE7绘制碳青霉烯类耐药大肠埃希菌系统进化树。

6株产碳青霉烯酶大肠埃希菌中，PCR检测出3种碳青霉烯酶基因，即bla_KPC-2、bla_NDM-1、bla_NDM-5各2株。菌株临床资料见表1。

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表1

6株碳青霉烯耐药大肠埃细菌资料

表1

6株碳青霉烯耐药大肠埃细菌资料

菌株	分离时间(年)	病区	种类	耐药基因	ST分型	ERIC分型
E-84	2013	重症监护病房	痰液	blaKPC-2	648	C
E-95	2014	急诊重症监护病房	痰液	blaKPC-2	410	B
E-135	2015	血液内科	血液	blaNDM-5	167	D
E-146	2015	创伤外科	痰液	blaNDM-1	617	A
E-149	2015	创伤外科	尿液	blaNDM-1	617	A
E-151	2015	泌尿外科	尿液	blaNDM-5	101	B

6株碳青霉烯耐药大肠埃希菌中，4株(J95、J135、J149、J151)接合成功，PCR扩增测序证实含有与野生菌相同的耐药基因。药敏试验结果显示，野生菌株均为泛耐药菌，仅E84、E146对阿米卡星敏感，E151对氨曲南敏感，E95对阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素敏感，所有菌株对多黏菌素B和替加环素都敏感。接合子部分抗菌药物耐药性降低，与野生菌株存在差异(表2)。

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表2

大肠埃细菌及接合子最低抑菌浓度(MIC，μg/mL)

表2

大肠埃细菌及接合子最低抑菌浓度(MIC，μg/mL)

抗菌药物	E84	E95	J95	E135	J135	E146	E149	J149	E151	J151
亚胺培南	8	8	≥ 16	≥ 16	≥ 16	≥ 16	≥ 16	≥ 16	≥ 16	≥ 16
妥布霉素	8	≤　1	≤　1	≥ 16	≥ 16	≥ 16	≥ 16	≤　1	≥ 16	≤　1
阿米卡星	≤　2	≤　2	≤　2	≥ 64	≥ 64	≤　2	≥ 64	≤　2	≥ 64	≤　2
环丙沙星	≥　4	≥　4	≤　0.25	≥　4	≤　0.25	≥　4	≥　4	≤　0.25	≥　4	≤　0.25
左氧氟沙星	≥　8	≥　8	≤　0.25	≥　8	≤　0.25	≥　8	≥　8	≤　0.25	≥　8	≤　0.25
复方磺胺甲恶唑	≥320	≥320	≥320	≥320	≤ 20	≥320	≥320	≤ 20	≥320	≤ 20
厄他培南	≥　8	≥　8	≥　8	≥　8	≥　8	≥　8	≥　8	4	≥　8	≥　8
氨曲南	≥ 64	≥ 64	≥ 64	≥ 64	16	≥ 64	≥ 64	≤　1	≤　1	≤　1
头孢吡肟	≥ 64	8	4	≥ 64	≥ 64	≥ 64	≥ 64	≥ 64	≥ 64	≥ 64
庆大霉素	≥ 16	≤　1	≤　1	≥ 16	≥ 16	≥ 16	≥ 16	≤　1	≥ 16	≤　1
头孢替坦	32	32	≤　4	≥ 64	≥ 64	≥ 64	≥ 64	≥ 64	≥ 64	≥ 64

注：E84、E95、E135、E146、E149、E151为临床分离产碳青霉烯酶大肠埃希，J95、J135、J149、J151为相对应的接合子。

ERIC-PCR分型发现4种克隆群：A(E146、E149)、B(E95、E151)，C(E84)和D(E135)，结果见图1。

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图1

6株大肠埃希菌肠杆菌基因间重复共有序列聚合酶链反应分型电泳结果

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注：M.标准带

图1

6株大肠埃希菌肠杆菌基因间重复共有序列聚合酶链反应分型电泳结果

6株碳青霉烯耐药大肠埃希菌共得到5种ST型，ST648、ST410、ST167、ST617、ST101(表3)。5种ST型通过eBRUST V3软件分组分析有1个分型组和3个单体型，ST167与ST617型耐药菌，7个管家基因中6个相同，遗传背景相似，来源于相同的ST10Cplx，亲缘关系较近，分为一组，而ST101、ST410、ST648则是散发存在的单体型，各不同分组的ST型7个管家基因基本不同，遗传背景相差较大，亲缘关系都相距较远。检索Pubmed共收集到70种碳青霉烯耐药大肠埃细菌MLST分型数据，采用非加权组平均法(UPMGA)在MAGE7绘制系统进化树(图2)。

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表3

碳青霉烯耐药大肠埃希菌多位点序列分型(MLST)分型结果

表3

碳青霉烯耐药大肠埃希菌多位点序列分型(MLST)分型结果

菌株	ADK	FUMC	GYRB	ICD	MDH	PURA	RECA	ST	克隆复合体
E84	92	4	87	96	70	58	2	648	ST648	Cplx
E95	6	4	12	1	20	18	7	410	ST23	Cplx
E135	10	11	4	8	8	13	2	167	ST10	Cplx
E146	10	11	4	8	8	13	73	617	ST10	Cplx
E149	10	11	4	8	8	13	73	617	ST10	Cplx
E151	43	41	15	18	11	7	6	101	ST101	Cplx

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图2

碳青霉烯耐药大肠埃希菌系统进化树(UPMGA)

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注：带标记的为本研究中的ST型

图2

碳青霉烯耐药大肠埃希菌系统进化树(UPMGA)