临床实验研究
粪肠球菌临床分离株的毒力与耐药基因研究
中华临床感染病杂志, 2018,11(4) : 297-301. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2018.04.009
引用本文: 钟建平, 金法祥, 王华钧, 等.  粪肠球菌临床分离株的毒力与耐药基因研究 [J] . 中华临床感染病杂志, 2018, 11(4) : 297-301. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2018.04.009.
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肠球菌属在自然界广泛分布,不仅存在土壤、水体、植物中,也存在于人、哺乳动物、爬行动物和昆虫的肠道[1]。肠球菌属为条件致病菌,在医院感染中粪肠球菌最常见的为尿路感染,在尿液中的分离率占第二位(仅次于大肠埃希菌)[2]。多年来,尽管国内各地粪肠球菌临床分离株对万古霉素与替考拉宁等糖肽类抗菌药物的敏感性较高,但对青霉素、红霉素、氨基糖苷类药物(高浓度)及四环素等的耐药性较高[3,4,5,6]。国内关于肠球菌耐药基因报道较多[7,8,9,10,11],但鲜见涉及毒力基因的研究报道。谢晓等[12]作了肝胆外科患者感染肠球菌耐药基因与毒力基因检测报道,但未对菌株进行粪肠球菌和屎肠球菌分类分析。最近陈敏强等[13]报道了肠球菌的7种毒力基因研究(但仅有7株粪肠球菌)。为了较全面了解粪肠球菌的毒力基因与耐药基因状况,本研究对23株粪肠球菌进行了7种毒力基因和9种耐药基因检测,并对检测结果作样本聚类分析,进而了解毒力基因与耐药基因在粪肠球菌中的分布情况。

1 材料与方法
1.1 菌株来源

23株粪肠球菌分离自2015年1月至2016年12月绍兴市立医院内科住院患者的尿液标本。菌种鉴定为法国生物梅里埃公司全自动微生物鉴定仪Vitek 2 Compact型。

1.2 药敏试验

抗菌药物敏感性试验均采用K-B药敏纸片法,按2014年美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的规则及标准进行。药敏纸片均为英国Oxoid公司产品。

1.3 细菌核酸提取制备

细菌核酸提取制备采用非离子去污剂裂解法(裂解液A)和蛋白酶K消化法(裂解液B)消化法。裂解液A与裂解液B均购自无锡市克隆遗传技术研究所。挑取菌落按照试剂盒说明书操作即可。

1.4 基因检测和测序

采用PCR法对粪肠球菌7种毒力基因与9种耐药基因进行检测。PCR法检测引物序列均由无锡市新吴区新克隆数据分析工作室提供,PCR引物与产物参数见表1。PCR法通用扩增试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供,按说明书操作。部分PCR扩增产物委托上海铂尚生物技术公司作测序加以验证,测得序列用Chromas软件作BLASTn法上网比对。

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表1

粪肠球菌毒力基因与耐药基因PCR扩增引物序列和目的产物长度

表1

粪肠球菌毒力基因与耐药基因PCR扩增引物序列和目的产物长度

基因分类基因名称PCR引物序列(5′→3′)产物长度(bp)
毒力基因aceP1:GGGGCGTTATTGATTGGTCCA423
  P2:CGTCAAACGTTGAGTCGCCG 
 asa1P1:GAAGCATTGGGTGGTAGCCC380
  P2:CTGTTGGCTGCCCTAGAGGT 
 efaAP1:GGTTGCGGAAAGCAGGCTTCT239
  P2:CCTGTTTCAAGATTCAAACCG 
 ebpAP1:ATGACGACCACAGGGAAGAAA395
  P2:CGATCAGCTTGTTTGCCTGGC 
 gelEP1:GTTTCAACAGTTTTATCGAAGTTG363
  P2:AAGATCTTTAGTTTCCGGATTATC 
 hylP1:TATGGGTAATGCTGGTCGG216
  P2:CTTGCTTCGTGTTTGCGA 
 cylP1:ATGGAAAATTTAAGTGTAGTTCC207
  P2:TTAACAATGTTTTAAAGACAC 
青霉素耐药基因blaP1:AGGAAGAGTATGATTCAACA535
  P2:CTCGTCGTTTGGTATGGC 
红霉素耐药基因ermAP1:AGCGGTAAACCCCTCTGAG457
  P2:TAGTGACATTTGCATGCTTCAA 
 ermBP1: GAAAAGGTACTAAACCAAATA616
  P2:AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC 
 ermCP1:ACTTGTTGATCACGATAATTTCCA321
  P2:TCTACTTAATCTGATAAGTGAGCTATTCAC 
 mefAP1:ACTATCATTAATCACTAGTGG346
  P2:TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG 
氨基糖苷类耐药基因aac(6′)/aph(2″)P1:CCAAGAGCAATAAGGGCATA220
  P2:CACTATCATAACCACTACCG 
 aph(3)-ⅢP1:GCCGATGTGGATTGCGAAAA292
  P2:GCTTGATCCCCAGTAAGTCA 
 ant(6)-ⅠP1:ACTGGCTTAATCAATTTGGG597
  P2:GCCTTTCCGCCACCTCACCG 
四环素耐药基因tetMP1:GTGTGACGAACTTTACCGAA501
  P2:GCTTTGTATCTCCAAGAACAC 
1.5 毒力基因与耐药基因的样本聚类分析

将粪肠球菌7种毒力基因与9种耐药基因检测结果委托无锡新吴区新克隆数据分析工作室作UPGMA法样本聚类分析。

2 结 果
2.1 药敏试验

23株粪肠球菌对万古霉素与替考拉宁完全敏感,除对青霉素G耐药率为26.09%外,对其他5种抗菌药物耐药率均较高,8种抗菌药物的药敏试验结果见表2

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表2

23株粪肠球菌对8种抗菌药物药敏试验结果[株(%)]

表2

23株粪肠球菌对8种抗菌药物药敏试验结果[株(%)]

抗菌药物耐药敏感
青霉素G6(26.09)17( 73.91)
红霉素15(65.22)8( 34.78)
高浓度庆大霉素17(73.91)6( 26.09)
高浓度链霉素17(73.91)6( 26.09)
四环素13(56.52)10( 43.49)
环丙沙星10(43.49)13( 56.52)
万古霉素023(100.00)
替考拉宁023(100.00)
2.2 基因检测

23株粪肠球菌中,有21株(91.30%)至少检出1种以上毒力基因,20株(86.96%)至少检出1种以上耐药基因。毒力基因和耐药基因检测情况见表3图1图2图3为基因测序图。

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图1
粪肠球菌毒力基因ace测序图(经BLASTn上网比对确认为ace基因序列)
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图1
粪肠球菌毒力基因ace测序图(经BLASTn上网比对确认为ace基因序列)
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图2
粪肠球菌毒力基因asa1测序图(经BLASTn上网比对确认为asa1基因序列)
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图2
粪肠球菌毒力基因asa1测序图(经BLASTn上网比对确认为asa1基因序列)
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图3
粪肠球菌毒力基因efaA测序图(经BLASTn上网比对确认为efaA基因序列)
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图3
粪肠球菌毒力基因efaA测序图(经BLASTn上网比对确认为efaA基因序列)
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表3

23株粪肠球菌7种毒力基因与9种耐药基因检测阳性率

表3

23株粪肠球菌7种毒力基因与9种耐药基因检测阳性率

基因分类阳性株数阳性率(%)
毒力基因  
 ace2086.96
 asa1313.04
 efaA28.70
 ebpA14.35
 gelE1356.52
 hyl834.78
 cyl00
青霉素耐药基因  
 bla626.09
红霉素耐药基因  
 ermA00
 ermB1565.22
 ermC00
 mefA00
氨基糖苷类耐药基因  
 aac(6′)/aph(2″)1562.22
 aph(3)-Ⅲ1252.17
 ant(6)-Ⅰ834.78
四环素耐药基因  
 tetM1356.52
2.3 毒力基因与耐药基因的样本聚类分析

对粪肠球菌7种毒力基因与9种耐药基因PCR检测结果作UPGMA法样本聚类分析,23株粪肠球菌可分为20个分类单元。样本聚类分析得出的各分类单元成员及基因携带状况见表4

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表4

23株粪肠球菌根据样本聚类分析得出的各分类单元成员及基因携带状况

表4

23株粪肠球菌根据样本聚类分析得出的各分类单元成员及基因携带状况

分类单元成员(菌株号)株数构成比(%)毒力基因耐药基因
214.35aceasa1、gelE、hylaac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ、ant(6)-Ⅰ、ermB、tetM
314.35aceasa1、gelE、hylaac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ、ermB
814.35aceasa1、hylaac(6′)/aph(2″)
714.35aceaac(6′)/aph(2″)、ermB
2114.35acegelEaac(6′)/aph(2″)、ermB
2214.35acegelEaac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ
1314.35acegelEant(6)-Ⅰ
1514.35acegelE、hyl未检出
18,2328.70acegelE未检出
1714.35未检出tetM
1614.35aceermB、tetM
1014.35acegelE、hylaph(3)-Ⅲ、ant(6)-Ⅰ、ermB、tetM
1114.35acegelE、hylermB、tetM
1914.35acegelE、hylaac(6′)/aph(2″)、ant(6)-Ⅰ、ermB、tetM
114.35aceefaA、gelEaac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ、ant(6)-Ⅰ、ermB、tetM
514.35acegelEaac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ、ant(6)-Ⅰ、ermB、tetM
6,2028.70aceaac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ、ant(6)-Ⅰ、ermB、tetM
1214.35未检出aac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ、ermB、tetM
9,1428.70aceaac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ、ermB、tetM
414.35efaA、ebpA、gelEaac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ
合计23100.00
3 讨论

肠球菌是一种条件致病菌,可引起泌尿系感染、肺部感染、菌血症、腹腔感染、伤口感染等,为医院内最常见的感染病原菌之一[1]。粪肠球菌导致人与动物感染性疾病是因为该细菌部分菌株携带各种毒力因子,这些毒力因子为黏附毒素、侵袭性酶或细胞毒素等,毒力因子由毒力基因编码。

ace基因编码胶原蛋白黏附毒素,使得菌株可以粘附于宿主细胞间质里的胶原蛋白上,有利于菌株定植。asa1基因编码聚合物属于黏附毒素。efaA基因是与心内膜炎相关的黏附毒素,编码肠球菌的纤维粘连蛋白结合蛋白A,ebpA基因编码与心内膜炎和生物被膜相关的菌毛,属于黏附毒素。gelE基因编码明胶酶E,是一种蛋白酶,属于侵袭性酶。hyl基因编码透明质酸酶,是宿主细胞之间的重要介质分子,而菌株产透明质酸酶即可降解透明质酸而破坏透明质酸的物理阻挡作用,所以透明质酸酶是一种侵袭性酶。cyl基因编码细胞毒素(Cytolysin)[1]

本研究尿液分离到的23株粪肠球菌中,21株检出至少存在1种毒力基因,毒力基因总检出率达91.30%,其中acegelE、hyl 3种毒力基因检出率较高,阳性率分别达86.96%、56.52%和34.78%。这与23株粪肠球菌均分离自尿路感染患者相符。asa1、efaA、ebpA 3种毒力基因也有检出,但检出率不高。研究菌株均没有检出cyl编码细胞毒素基因,而该基因由质粒介导所表达的毒素毒力致病性极强。

国内对肠球菌临床分离株的耐药性监测已有报道[2,3,4,5,6]。研究结果显示,菌株对万古霉素与替考拉宁等糖肽类抗菌药物全部敏感(因此本研究未作糖肽类药物耐药基因检测),对青霉素耐药率为26.09%,属于中度耐药;但对红霉素、高浓度的庆大霉素、高浓度的链霉素、四环素和环丙沙星耐药率均在40.00%以上,提示对上述抗菌药物耐药性严重。幸运的是可选用青霉素和万古霉素,故患者病情得到控制。

耐药基因检测检出bla青霉素耐药基因,阳性率为26.09%,与青霉素表型一致。红霉素耐药基因检出ermB,阳性率为65.22%,与红霉素表型一致。氨基糖苷类耐药基因检出aac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ、ant(6)-Ⅰ氨基糖苷类修饰酶基因,基因检出率与表型一致。四环素耐药基因检出tetM,阳性率为56.52%,与四环素表型一致。23株粪肠球菌中只有3株没有检出任何耐药基因,耐药基因总检出率达86.96%。

对23株粪肠球菌作样本聚类分析,各分类单元成员及基因携带状况显示,每株粪肠球菌均携带毒力基因或耐药基因,2株菌株未检出毒力基因,3株菌未检出耐药基因。从本文毒力基因与耐药基因全景式的研究可见粪肠球菌携带毒力基因与耐药基因较为严重,粪肠球菌对常用抗菌药物以及新上市的抗菌药物耐药性不断在演化中,最近国外已报告了耐利奈唑胺的粪肠球菌菌株,值得引起重视[14,15]

利益冲突
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