流感病毒是流行性感冒的病原体，该类病毒传播速度快、感染性强，对公共卫生造成重大威胁。目前，一线抗流感病毒药物神经氨酸酶抑制剂已在临床上广泛使用，相应的耐药株逐渐出现，为流感的防治带来困难。本文对流感病毒结构特点、耐药分子机制、耐药株流行现状和耐药性检测方法作了综述，旨在为今后的流感病毒耐药性研究和临床用药提供参考。
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流行性感冒(Influenza，简称流感)是一种由流行性感冒病毒(Influenza virus，简称流感病毒)引起的常见呼吸道传染病。据统计，流感病毒每年会造成全球300～500万例严重病例和25～50万例死亡病例[1]。2018年，世界卫生组织(World health organization, WHO)将流感列为全球公共卫生十大威胁之首[2]。目前，国际上预防与治疗流感的主要措施有疫苗接种和药物治疗，疫苗研究滞后，使用受限，抗流感药物使用方便、见效快，因此抗病毒药物在防治流感方面发挥了重要作用。临床上主要有两种抗流感病毒药物，即M2离子通道阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂(Nueraminidase inhibitors，NAIs)；但M2离子通道阻滞剂只对甲型流感病毒有效，且药物不良反应大，大部分流感病毒对其耐药且耐药株产生迅速[3]，故WHO建议M2离子通道阻滞剂耐药性监测不再为各国流感中心监测的主要任务，临床上也建议不再使用该类药物防治流感[4]。相比之下，NAIs对甲型和乙型流感均有效[5,6]，在卫生部颁发的《人禽流感诊疗方案(2005版)》中[7]，奥司他韦被列为抗流感病毒治疗的首选药物和WHO推荐的人禽流感预防和治疗的储备药物。然而，随着抗病毒药物的广泛应用，流感病毒易发生变异，流感病毒耐药仍是当下需要密切关注的公共卫生问题。本文重点讨论流感病毒对NAIs的耐药机制和研究进展。
流感病毒是隶属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的包膜病毒[8]，主要分为甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)3种类型；其中，甲型流感病毒(Influenza A viruses，IAVs)抗原变异频繁，传染性强，常引起暴发流行；乙型流感病毒(Influenza B viruses，IBVs)和丙型流感病毒(Influenza C viruses，ICVs)抗原性非常稳定[9]。人类主要感染甲型和乙型流感病毒，甲型和乙型流感病毒的遗传物质由8个独立的单股负链RNA组成，分别编码17种和11种蛋白质[10]，其中神经氨酸酶(Nueraminidase，NA)是病毒包膜上的一种四聚体蛋白，在新病毒颗粒脱离宿主细胞的过程中，病毒颗粒通过唾液酸粘附于宿主细胞表面，NA能够催化唾液酸水解，协助病毒脱离宿主细胞，促进子代病毒释放[11]，在流感病毒的复制和传播中起到了关键作用，继而成为各类NAIs的作用靶点。
NAIs是继M2离子通道阻滞剂之后的一类全新作用机制的抗流感药物。NAIs通过与NA的特异性结构域结合，阻断其活性位点并降低NA水解细胞表面唾液酸的水解酶活性，从而抑制病毒释放与细胞间传播，发挥抗病毒作用[12,13]。相较于M2离子通道阻滞剂，NAIs的应用更为广泛，已成为目前临床上最主要的抗流感病毒药物。NAIs主要有4种：奥司他韦(Oseltamivir，商品名为达菲)、扎那米韦(Zanamivir)、帕拉米韦(Paramivir)和拉尼那米韦(Laninamivir)。扎那米韦是首先被研制出的抗流感病毒NAIs。研究者将一种NA抑制物2，3-脱氢2-脱氧N-乙酰神经氨酸(DANA)的C4-羟基用C4-胍基取代，使DANA与NA的结合力增强，更有效抑制NA活性，从而研制出扎那米韦。该药于1999年7月被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，用于治疗甲型和乙型流感病毒引起的流感[3]。扎那米韦在体内代谢迅速，口服给药时生物利用率仅为2%～3%，因此需要吸入给药，对有呼吸系统疾病或老幼患者使用很不方便，这极大限制了其临床应用[14]。奥司他韦的研制基于扎那米韦，其DANA结构中的C4和甘油侧链分别被氨基和疏水性戊醚侧链代替。奥司他韦片剂是第一个口服的高活性NAIs[14]，可通过肝酯酶转化为活性化合物奥司他韦羧酸盐，将药物生物利用度提高到80%[15,16]，于1999年10月在美国批准上市后广泛应用于临床[3]。此外，帕拉米韦和拉尼那米韦是临床上使用较少的两种抗流感病毒药物。帕拉米韦只能静脉注射[17]，当患者对奥司他韦耐药且不能吸入给药时可考虑使用此药。拉尼那米韦虽是一种长效NAIs，但需要吸入给药，限制了临床应用。目前帕拉米韦在中国也被批准使用，拉尼那米韦主要在美国、韩国、日本等国家被批准使用[13,18,19]。
流感病毒对抗病毒药物的敏感性常用半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration，IC50)来衡量。IC50是指NA酶活性被抑制50%时的NAIs浓度，IC50升高意味病毒对药物的敏感性降低。WHO通过待测毒株与药物敏感参考株IC50的比值，将流感病毒NAIs耐药性划分为3个水平：(1)正常抑制：甲型流感病毒，IC50升高小于10倍；乙型流感病毒，IC50升高小于5倍；(2)抑制性降低：甲型流感病毒，IC50升高10～100倍；乙型流感病毒，IC50升高5～50倍；(3)抑制性高度降低：甲型流感病毒，IC50升高大于100倍；乙型流感病毒，IC50升高大于50倍[20]。
流感病毒的RNA聚合酶容易发生错配，随着临床上NAIs使用的增加，相应的NAIs耐药毒株也逐渐出现[21]。目前认为，流感病毒对NAIs耐药的分子机制主要是编码NA的病毒RNA片段发生基因突变，使组成NA的一个或多个氨基酸残基发生改变，最常见的改变有氨基酸残基替换(Substitution)[22]和氨基酸残基缺失(Deletion)[23]。NA蛋白酶活性位点或附近氨基酸残基的替换或者缺失可直接或间接引起NA酶活性位点空间构象改变[13,19]和酶功能受损，导致NA不能与NAIs高亲和力地结合，从而产生耐药株。甲型和乙型流感病毒NA上均具有8个保守功能性残基(R118、D151、R152、R224、E276、R292、R371和Y406)和11个框架残基群(E119、R156、W178、S179、D198、I222、E227、H274、E277、N294和E425)(N2 numbering)，这些残基群共同维持了NA蛋白酶活性位点的稳定性[21]。研究表明，当NA蛋白上E276氨基酸旋转并与R224氨基酸结合时，奥司他韦才能与NA结合并抑制病毒[24]，扎那米韦发挥抗病毒作用主要依赖于胍基与NA活性中心E119残基相互作用[19]，这些NA上氨基酸位点改变均会降低药物结合NA的亲和性，导致病毒耐药。帕拉米韦同时具有疏水侧链和胍基[25]，故导致奥司他韦和扎那米韦耐药的NA氨基酸位点改变也可使病毒对帕拉米韦的敏感性降低。目前，关于拉尼那米韦的耐药机制研究较少。此外，也有研究发现血凝素受体结合部位或其周围发生突变可使流感病毒芽生释放时对NA功能的依赖性降低，从而导致流感病毒对NAIs的敏感性降低[26]，这可能与病毒受体亲和力降低和免疫逃逸有关[27]。
由于不同NAIs的化学结构存在差异，因此NA基因上一些位点突变并不会降低病毒对所有NAIs的敏感性。如I222V(N2 numbering)主要导致病毒对奥司他韦耐药，H274Y(N2 numbering，N1 numbering为H275Y)主要导致病毒对奥司他韦和帕拉米韦耐药。此外，NA活性位点上一些氨基酸虽高度保守，但一些突变只在特定流感病毒中产生。例如H274Y变异只在N1亚型中产生并导致耐药[14,28]。
随着NAIs的广泛应用，流感病毒耐药株逐渐出现。临床与研究发现，耐药病毒株容易在儿童、65岁以上老人和免疫功能低下者体内分离出，严重影响患者的生命健康，为流感病毒感染的治疗增添严重障碍。
在已报道的NAIs耐药毒株中，N1亚型最多。N1亚型中最常见的NAIs耐药性突变为H274Y(N2 numbering)。H274Y突变仅导致N1亚型耐药，在季节性H1N1、新型甲型H1N1流感病毒[Pandemic influenza A(H1N1)pdm09，后简称H1N1pdm09]和高致病性H5N1禽流感病毒中均可产生[13,14]，主要导致病毒对奥司他韦和帕拉米韦耐药，病毒对两种NAIs的IC50升高普遍大于50倍[14,28]。
在NAIs被批准使用后的前3年(1999至2002年)，临床上几乎未检测到耐药甲型流感病毒株[13]。2005至2007年，全球分离出的季节性H1N1中奥司他韦耐药株仅为0.4%～0.6%，2007至2008年该药耐药株的分离率升高了7%。据美国CDC统计，直到2009年4月H1N1pdm09出现之前，>99%的季节性H1N1分离株为奥司他韦耐药株[3,13]。除H274Y之外，季节性H1N1流感病毒中常见的NAIs耐药突变还有N70S、Q136K和Y155H等[14]。
自从2009年H1N1pdm09出现并造成全球大流行后，季节性H1N1流感病毒已几乎被NAIs敏感的H1N1pdm09取代[13]。据统计，2009年4月至2010年1月分离的H1N1pdm09中，几乎所有毒株对NAIs敏感[29]。2016至2017年，H1N1pdm09的NAIs耐药率为0.5%，相较于2015至2016年的1.8%，比例有所减少[30]。2018年，Huang等[31]通过分析中国大陆2016至2017年流感季节分离出的3 215株流感病毒的IC50发现，H1N1pdm09中最常见的NAIs位点为H275Y(N1 numbering)，且奥司他韦和扎那米韦耐药率为0.7%。此外，I222V、I222R和I222K(N2 numbering)等突变位点也在H1N1pdm09中发现。该位点突变主要使病毒对奥司他韦产生耐药，但对扎那米韦和帕拉米韦影响不大[32]。近年来研究表明，R152K、R292K、N294S(N2 numbering)、S110F和R368K(N1 numbering)也可导致H1N1pdm09耐药，其中S110F可导致奥司他韦和扎那米韦对病毒抑制性降低(IC50分别升高10.47和18.45倍)，R152K突变株也从拉尼那米韦-法匹拉韦(Favipiravir)联合治疗小鼠体内分离出[28,31,33]。
除单位点突变外，一株携带G147R-H275Y(N1 numbering)重叠突变的H1N1pdm09于2016年从日本1例免疫缺陷住院患者体内分离出来。这种双重突变株主要对奥司他韦和帕拉米韦耐药，但拉尼米韦和扎那米韦对其正常抑制。相关研究表明，147残基位于NA活性部位附近的150-环中，G147R氨基酸替换改变了150-环的稳定性，降低NA对NAIs的结合亲和力[22]。此外，E119(N2 numbering)位点突变(E119A、E119D、E119G等)也可单独或与H274Y联合导致H1N1pdm09对一种或多种NAIs耐药[28]。
2014年，Butler等[34]发现在一些NAIs耐药H1N1pdm09中存在一种容许(Permissive)突变，这种突变的主要功能是增强耐药突变病毒的适应性。例如V241I和N369K(N1 numbering)突变株对奥司他韦敏感性降低并可增强H275Y(N1 numbering)突变株的适应性。
NAIs耐药的季节性H3N2流感病毒在全球的检出率非常低，2007至2009年该病毒分离株均对奥司他韦敏感[13]。截止到2015年5月，>98%的季节性H3N2流感病毒全球分离株对NAIs普遍敏感[36,37]。最新的一项研究统计，2016至2017年分离的3 420株季节性H3N2流感病毒中，只有4株对NAIs耐药，耐药率仅为0.1%[30]。季节性H3N2流感病毒中最常见的NAIs耐药性突变为E119V(N2 numbering)，该突变主要导致奥司他韦耐药，IC50值升高大于50倍[14,38]。此外E119I毒株也在临床上分离到，此突变可以导致病毒同时对奥司他韦和帕拉米韦耐药。Simon等[39]研究发现，I222V可恢复E119V突变株的适应性，表明耐药突变位点之间可以相互影响。Abed等[40]已从1例免疫缺陷儿童体内成功分离出同时含有3个氨基酸替换(N146K、S219T、A272V)和4个氨基酸缺失(Del245-248)的奥司他韦耐药H3N2流感病毒株，并通过恢复试验证实该耐药株形成是245-248位点氨基酸缺失所致。近年来发现的耐药性突变还有R292K、N294S、Q136K和I222V (N2 numbering)[14,39,41,42]，这些突变可导致病毒对奥司他韦(R292K、N294S)、帕拉米韦(R292K)、扎那米韦(R292K、Q136K、I222V)耐药。
2013年，研究者首次分离出禽源性H7N9流感病毒，该病毒对公共健康造成威胁[43]，但病例仅散在出现。2013年4月WHO报道，中国开展的实验室检测表明H7N9禽流感病毒对NAIs敏感(奥司他韦和扎那米韦)[44]。近年来，已有报道表明部分H7N9禽流感病毒毒株产生NAIs耐药性，此病毒中比较常见的NAIs耐药突变是E119V和R292K[13,45,46]。此外，I222K和I222R也可导致H7N9对奥司他韦的抑制性降低[47]。
乙型流感病毒NAIs耐药株不如甲型流感病毒常见且检出率非常低，在0～1% [48]。乙型流感病毒耐药突变主要发生在D198(D198E、D198N)和R152K(N2 numbering)位点[49]。此外，I222T、S250G、G402S、R368K和E119(E119A、E119D、E119G)(N2 numbering)突变也可以导致奥司他韦(I222T、S250G、G402S、R368K和E119A/D/G)、帕拉米韦(E119A/D/G)和扎那米韦(S250G、G402S、R368K和E119A/D/G)耐药[14,50]。不同亚型流感病毒NA基因的耐药性突变位点总结见表1。
不同亚型流感病毒神经氨酸酶基因耐药性突变位点
不同亚型流感病毒神经氨酸酶基因耐药性突变位点
| 亚型 | 耐药突变位点a | 参考文献 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 奥司他韦 | 扎那米韦 | 帕拉米韦 | 拉尼那米韦 | |||
| 甲型 | 季节性H1N1流感病毒 | H274YH，N70SL，Q136KL，Y155HM | H274YL，H70SM，Q136KH，Y155HH | H274YH，Q136KH，Y155HH | － | [14] |
| 新型甲型H1N1流感病毒 | H274YH，I222VM，I222RM，I222KM，S247Nb，L，E119DM，E119A/GL，D198NL，R152KM，R292KM，N294SM，S110Fb，G147R/H275Yb，c，H，R368Kb，M，V241Ib，M，N369Kb，M | H274YL，I222VL，I222RL，I222KL，S247NL，E119DH，E119AM，E119GH，D198NL，R152KM，R292KL，N294SL，S110Fb，G147R/H275Yb，c，L，R368Kb，M | H274YH，I222RL，I222KL，S247NL，E119DH，E119AL，E119GM，D198NL，R152KM，R292KL，N294SL，G147R/H275Yb，c，H，R368Kb，H | R152KM，G147R/H275Yb，c，L，R368Kb，L | [22,28,31,32,33,34] | |
| 高致病性H5N1禽流感病毒 | H274YH，I222VL，I222TM，I222MM，I222LM，N294SM，H252YM，E119AM，S246NM | H274YL，I222VL，I222TL，I222ML，I222LL，N294SL，H252YL，E119AH，S246NL | H274YH，I222VL，I222TL，I222ML，N294SL，H252YL | － | [6,13,35] | |
| 季节性H3N2流感病毒 | E119VH，E119IH，R292KH，N294SH，Q136KL，I222VM，DEL245-248d，H | E119VL，E119IL，R292KM，N294SL，Q136KM，I222VL，DEL245-248d，L | E119VL，E119IH，R292KH，N294SL，I222VL，DEL245-248d，L | － | [14,38,39,40,41,42] | |
| 甲型H7N9禽流感病毒 | E119VM，R292KH，I222KM，I222RM | E119VL，R292KM，I222KL，I222RM | E119VL，R292KH，I222KL，I222RM | E119VL，R292KM，I222KM，I222RM | [13,45,46,47] | |
| 乙型 | E119AH，E119DH，E119GM，R152KH，D198NH，D198EM，I222TH，S250GM，G402SH，R368KH | E119AH，E119DH，E119GM，R152KH，D198NM，D198EL，I222TM，S250GH，G402SM，R368KM | E119AH，E119DH，E119GH，R152KH，D198NL，D198EM | － | [14,49] | |
注："－"．无相关数据；a.按照N2序列；b.按照N1序列；c.重叠突变；d.氨基酸缺失；L.IC50升高甲型<10倍，乙型<5倍；M.IC50升高甲型10～100倍，乙型5～50倍；H.IC50升高甲型>100倍，乙型>50倍
目前，流感病毒NAIs耐药性检测方法基本上可以分为两类：表型分析和基因型分析。表型分析法是流感病毒耐药检测的"金标准"[51]，但由于表型分析耗时较长，病毒在细胞中传代后可能会改变原始临床标本中耐药株的比例或产生新的突变，表型分析法常与基因型分析法联合检测流感病毒耐药性。
基因型分析法常通过荧光PCR和测序方法检测NA基因上耐药突变位点来判断毒株是否耐药[52,53]。该方法直接利用临床标本从基因水平检测耐药突变位点，并可获得耐药株在混合毒株中所占的比例[54]。全基因组测序[53]在流感病毒耐药研究中的应用也很广泛，该方法可获得病毒所有片段的序列信息，并通过生物信息软件分析获得耐药相关位点[45]。此外，滚环扩增法(Rolling circle amplification，RCA)[55]和基因芯片法[56]等耐药基因型分析方法也被开发并广泛应用。在流感病毒耐药性研究中，研究人员应根据实验室检测设备条件取长补短，选择最合适的方法对流感病毒进行耐药性检测。
流感病毒在全球均可引起季节性流行，甲型流感病毒可引起全球大流行。随着新型毒株的出现，人群缺乏免疫性而加大药物治疗剂量，抗病毒药物的广泛使用导致病毒耐药时有发生，流感病毒耐药仍是当下需要密切关注的公共卫生问题。近年来，甲型流感病毒的优势流行株(H1N1pdm09和季节性H3N2流感病毒)和乙型流感病毒对临床上常用的NAIs(奥司他韦和扎那米韦)耐药率并不高，保持在2%以内[30,48]，说明常规抗病毒药物对防治大部分流感效果良好。但是，亦有研究表明耐药株容易在儿童、65岁以上老人、有基础疾病的重症患者、严重免疫缺陷患者以及常规抗病毒治疗无效者体内分离出[57]。可见，流感病毒耐药性的实验室检测对指导临床用药至关重要。研究表明，药物与天然底物的区别越小，耐药越不容易发生，奥司他韦与DANA相比有两处变化，相对于扎那米韦，流感病毒对奥司他韦耐药更常见[14]。因此有报道指出，对于分离出耐药毒株的患者来说，出现奥司他韦耐药时可选择扎那米韦治疗或者联合用药[57]。与此同时，新药物靶点不断发现，新型抗流感药物也在不断研究和开发，如RNA聚合酶抑制剂、HA受体阻断剂和单克隆抗体等[58]，这些药物也将在抗NAIs耐药毒株方面起到一定作用。此外，患者诊疗方案的优化还需要实验室与临床的紧密联系，患者的临床标本应该及时送检，实验室也应将耐药性检测结果及时反馈给临床。总而言之，流感病毒的耐药性监测和耐药机制的研究对于流感的诊断和治疗具有非常重要的意义。
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