通过全基因组测序(Whole genome sequencing，WGS)分析碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia，CRKP)的耐药基因携带情况。
收集2013年1月至2014年2月浙江中医药大学附属第二医院临床分离的30株CRKP，测定其对16种抗菌药物的敏感性，通过二代测序平台对所有菌株进行基因组测序并进行耐药基因筛选。
30株CRKP分离自8个不同临床科室，标本主要来源于痰液和尿液。药敏试验显示，30株CRKP对碳青霉烯类、头孢菌素类及β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂合剂均不敏感；对环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星和复方磺胺甲噁唑的耐药率>70%；对多黏菌素E和替加环素的敏感率高，分别为100.0%和90.0%。经WGS检测共发现48种耐药基因。30株CRKP均携带blaKPC-2，29株(96.7%)同时携带多种超广谱β-内酰胺酶(Exterded spectrum β-lactamases，ESBLs)耐药基因；氨基糖苷类耐药基因以rmtB和aadA2为主；27株(90.0%)同时携带oqxA和oqxB喹诺酮类耐药基因；3种磷霉素耐药基因中，29株(96.7%)携带fosA，18株(60.0%)携带fosA3；23株(76.7%)CRKP携带sul1的磺胺类耐药基因；30株还同时携带不同型别的ESBLs、氨基糖苷类和磷霉素耐药基因。其中，28株(93.3%)还同时携带喹诺酮类耐药基因。所有菌株的耐药表型与耐药基因型在所测β-内酰胺类抗菌药物和多黏菌素完全符合，在氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物中也存在较高的一致性。
CRKP同时携带多种抗菌药物耐药基因，呈现多重耐药表型。WGS在预测细菌耐药表型方面具有较高的应用前景。
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肺炎克雷伯菌是院内获得性感染中最为常见的致病菌之一，主要引起肺炎、败血症、尿路感染、肝脓肿及腹膜炎等。随着抗菌药物的广泛使用，尤其是碳青霉烯类抗生素的大量或不合理使用，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia，CRKP)呈现全球播散趋势，在我国分离率逐年攀升，已成为严重的公共卫生安全问题[1,2]。CRKP常呈现多重耐药表型，给临床治疗带来了极大的挑战。研究表明，CRKP的多重耐药表型与其同时携带多种耐药基因相关[3]。因此，该研究旨在通过全基因组测序(Whole genome sequencing，WGS)分析本院分离的CRKP的耐药基因型，了解其与耐药表型的相关性，为CRKP的临床治疗和院感防控提供科学的理论依据。
收集2013年1月至2014年2月于浙江中医药大学附属第二医院临床分离的CRKP 30株：21株来源于痰液标本，5株来源于尿液标本，2株来源于血液标本，各有1株分别来源于胃造口分泌物及盆腔引流物标本；分离自8个不同的临床科室，其中神经外科14株，重症监护室(Intensive care unit，ICU)9株，消化内科2株，呼吸内科、肛肠外科、血管外科、泌尿外科及骨科各1株。所有菌株均采用Vitek 2细菌全自动鉴定仪进行菌种及药敏鉴定。大肠埃希菌ATCC25922为药敏试验质控菌株。
LB肉汤培养基购自上海生工生物工程有限公司；Mueller-Hinton(MH)琼脂粉购自英国Oxoid公司；药敏纸片：包括美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、氨苄西林、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、复方磺胺甲噁唑共14种均购自Oxoid公司；替加环素和多黏菌素药敏试验粉剂购自法国梅里埃生物公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒、产物纯化试剂盒为美国Axygen公司产品。细菌基因组测序仪为美国Illumina Hiseq 2000高通量测序仪。
采用纸片琼脂扩散法(K-B法)测定14种抗菌药物的敏感性，具体方法参照临床实验室标准化研究所(Clinical and laboratory standard institute，CLSI)2018版[4]。微量肉汤稀释法测定TGC和CST的敏感性：将待测菌株调成0.5个麦氏浊度，以1∶20稀释，为上样菌液，用MH肉汤稀释待测抗菌药物溶液，无菌96孔板的第1列加入200 μL加药的肉汤，第2～11列加入100 μL未加药的MH肉汤，从第1列吸取100 μL肉汤加入第2列，混匀后再吸取100 μL肉汤至第3列，依次进行倍比稀释，最后100 μL肉汤弃之；无菌96孔板的每孔加入待测菌液10 μL，药物及菌液上样完毕后，封好膜，置于37℃孵箱培养18～22 h观察结果。以大肠埃希菌ATCC25922和NCTC13846为质控菌株。药敏结果判断标准参照CLSI 2018版[4]，其中，替加环素和多黏菌素则参照欧盟药敏试验标准(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)2018版[5]。
通过Illumina Hiseq 2000第二代高通量测序平台进行2×100 bp Paired-End测序，对所有菌株进行耐药基因的筛选：(1)基因组序列收到后，运用CLC Genomic Workbench 7.0软件对序列进行质量控制和拼接；(2)运用CGE网站(http：//cge.cbs.dcu.dk/services/ResFinder/)的ResFinder 2.1工具，对拼接后的contigs进行耐药基因筛选，得出30株CRKP携带的所有耐药基因。
根据药物敏感试验的耐药表型与WGS检测筛查出的耐药基因型一致者，定义为两者符合；否则，均视为不符合。1.6数据分析计数资料以例(百分数)表示。
30株CRKP对美罗培南、厄他培南和亚胺培南的耐药率分别为100.0%、100.0%和96.7%；对氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林钠/他唑巴坦和氨苄西林/舒巴坦耐药率均为100.0%；对环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星和复方磺胺甲噁唑的耐药率>70.0%；而对多黏菌素E和替加环素的敏感率高，分别为100.0%和90.0%(表1)。
30株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药情况[株(%)]
30株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药情况[株(%)]
| 抗菌药物 | 耐药 | 中介 | 敏感 |
|---|---|---|---|
| 美罗培南 | 30(100.0) | 0 | 0 |
| 亚胺培南 | 29( 96.7) | 1( 3.3) | 0 |
| 厄他培南 | 30(100.0) | 0 | 0 |
| 头孢吡肟 | 30(100.0) | 0 | 0 |
| 头孢噻肟 | 30(100.0) | 0 | 0 |
| 头孢他啶 | 30(100.0) | 0 | 0 |
| 头孢哌酮/舒巴坦 | 30(100.0) | 0 | 0 |
| 哌拉西林钠/他唑巴坦 | 30(100.0) | 0 | 0 |
| 氨苄西林/舒巴坦 | 30(100.0) | 0 | 0 |
| 氨苄西林 | 30(100.0) | 0 | 0 |
| 阿米卡星 | 26( 86.7) | 0 | 4( 13.3) |
| 庆大霉素 | 29( 96.7) | 0 | 1( 3.3) |
| 环丙沙星 | 27( 90.0) | 1( 3.3) | 2( 6.7) |
| 复方磺胺甲噁唑 | 14( 46.7) | 8(26.7) | 8( 26.7) |
| 替加环素 | 0 | 3(10.0) | 27( 90.0) |
| 多黏菌素E | 0 | 0 | 30(100.0) |
30株CRKP经WGS检测，共发现48种耐药基因。10种β-内酰胺类耐药基因中，30株均携带blaKPC-2，29株(96.7%)同时携带超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases，ESBLs)耐药基因，以blaTEM-1B和blaSHV-11最多，各有23株(76.7%)，15株(50.0%)携带blaCTX-M-65；11种氨基糖苷类耐药基因中，以rmtB(26株，86.7%)和aadA2(23株，76.7%)为主，其中22株(73.3%)同时携带两者；27株(90.0%)CRKP同时携带oqxA和oqxB两种喹诺酮类耐药基因；3种磷霉素耐药基因中，29株(96.7%)携带fosA，18株(60.0%)携带fosA3；磺胺类耐药基因有3种，主要基因sul1有23株(76.7%)细菌携带；氯霉素耐药基因共4种，catA2最多，有18株(60.0%)携带；另外在部分菌株中还检测到4种甲氧苄啶、大环内酯、林可胺和链霉素耐药基因，2种四环素类以及1种利福平耐药基因。30株CRKP除均携带blaKPC-2外，还同时携带不同型别的ESBLs耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、磷霉素耐药基因。其中，28株(93.3%)还同时携带喹诺酮类耐药基因(表2)。
30株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌携带常见耐药基因型[株(%)]
30株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌携带常见耐药基因型[株(%)]
| 耐药基因类型 | 携带耐药基因型 | 菌株构成比 |
|---|---|---|
| β-内酰胺酶 | blaKPC-2 | 30(100.0) |
| blaTEM-1B | 23( 76.7) | |
| blaSHV-11 | 23( 76.7) | |
| blaCTX-M-65 | 15( 50.0) | |
| blaCTX-M-14 | 9( 30.0) | |
| 其他 | 10( 33.3) | |
| 氨基糖苷类 | rmtB | 26( 86.7) |
| aadA2 | 23( 76.7) | |
| aph(3′)-Ⅰa | 6( 20.0) | |
| aac(3)-Ⅱd | 4( 13.3) | |
| aadA1 | 4( 13.3) | |
| 其他 | 11( 36.6) | |
| 喹诺酮类 | oqxA | 27( 90.0) |
| oqxB | 27( 90.0) | |
| QnrS1 | 5( 16.7) | |
| aac(6′)Ⅰb-cr | 3( 10.0) | |
| 磷霉素 | fosA | 29( 96.7) |
| fosA3 | 18( 60.0) | |
| fosA4 | 2( 6.7) | |
| 氯霉素 | catA2 | 18( 60.0) |
| cmlA1 | 5( 16.7) | |
| catB8 | 1( 3.3) | |
| floR | 1( 3.3) | |
| 磺胺类 | sul1 | 23( 76.7) |
| sul3 | 4( 13.3) | |
| sul2 | 3( 10.0) | |
| 甲氧苄啶 | dfrA14 | 9( 30.0) |
| dfrA12 | 4( 13.3) | |
| dfrA1 | 3( 10.0) | |
| dfrA27 | 1( 3.3) | |
| 四环素 | tet(A) | 4( 13.3) |
| tet(D) | 3( 10.0) | |
| 大环内酯、林可胺和 | ||
| 链霉素 | mef(B) | 4( 13.3) |
| mph(A) | 3( 10.0) | |
| mph(E) | 1( 3.3) | |
| msr(E) | 1( 3.3) | |
| 利福平 | ARR-3 | 1( 3.3) |
30株CRKP的耐药表型与耐药基因型符合率结果：碳青霉烯类、头孢菌素、青霉素类、β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂合剂、多黏菌素的符合率为100.0%，氨基糖苷类为96.7%，喹诺酮类为93.3%，复方磺胺甲噁唑为56.7%。
肺炎克雷伯菌作为医院内获得性感染中的主要致病菌，常以多重耐药菌株为主，尤其对碳青霉烯类耐药形势令人堪忧。从2005至2017年，中国细菌耐药监测网(China antimicrobial surveillance network，CHINET)显示，肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从3.0%和2.9%上升至20.9%和24.0%[2]。而这些菌株导致的感染常造成临床上无药可用。
细菌耐药性研究主要包括耐药表型和耐药基因型两方面。药敏试验是表型检测方法，但检测的抗菌药物种类有限，且有些细菌需要特殊培养环境；而基因型检测常用方法是聚合酶链反应(PCR)，只能检测已知的部分耐药基因，往往不够全面。传统的检测方法虽然有助于了解细菌耐药情况，但常耗时耗力，不能深入揭示其遗传背景，各有不足之处。随着测序技术的进步，WGS已较成熟，并逐渐应用于临床[6]。据报道，WGS能准确预测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌和结核分枝杆菌的耐药表型[7,8,9,10,11]。因此，基于WGS对CRKP的耐药性分析将有助于抗菌药物治疗的临床决策和医院感染的防控。
该研究结果显示，30株CRKP呈现多重耐药表型，对碳青霉烯类、三代头孢菌素、四代头孢菌素以及β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂合剂均不敏感，对喹诺酮类、氨基糖苷类表现出极高的耐药率，而对替加环素仅3株呈中介耐药，其余均敏感，多黏菌素则均敏感。基于WGS的耐药基因检测可见，30株CRKP均携带多种耐药基因，尤其是均携带blaKPC-2，可能是导致碳青霉烯类耐药的主要机制。同时，携带多种ESBLs耐药基因，已有研究报道，与头孢菌素耐药相关[12]。此外，CRKP还携带氨基糖苷类修饰酶基因、喹诺酮类耐药基因和16S rRNA甲基化酶基因，将导致临床氨基糖苷类和喹诺酮类治疗的失败，相关研究已证实[9,13]。磷霉素是目前多重耐药细菌治疗常用药物。据报道，产ESBLs大肠埃希菌对磷霉素的敏感率高达86%～100%[14]。Endimiani等[15]报道，包括对替加环素或多黏菌素不敏感的菌株在内的产KPC型酶肺炎克雷伯菌对磷霉素敏感率为87%～93%。该研究中，未进行磷霉素药敏试验检测，但从WGS检测结果中发现，30株CRKP均携带磷霉素耐药基因，主要是fosA和fosA3。可见，磷霉素在该类菌株感染治疗上可能均无效。国内有学者研究证实，携带blaKPC-2的肺炎克雷伯菌同时也携带fosA3耐药基因，而且可能是我国CRKP对磷霉素耐药的主要原因，本研究结果与其类似[16,17]。所有菌株对替加环素除3株表现中介耐药表型外，其余均敏感，检测到2种四环素类耐药基因型，均属于MFS型外排泵，但该型并不是导致替加环素耐药的主要机制。Mal系统、RND型外排泵和核糖体蛋白的基因突变则是替加环素主要耐药机制[18]。因此，3株替加环素不敏感菌株可能存在其他耐药机制。所有菌株未检测到多黏菌素耐药基因。结合多黏菌素耐药表型和耐药基因型可见，基于多黏菌素联合治疗是目前治疗CRKP的有效方案。
30株CRKP的耐药基因型与耐药表型在β-内酰胺类抗菌药物和多黏菌素完全符合，在氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物中也存在较高的一致性。因此，通过菌株的耐药基因型预测其耐药表型，具有指导抗菌药物选择的潜力。但部分抗菌药物如替加环素、多黏菌素或喹诺酮类等，其耐药机制可由固有基因突变所致[19,20]，而Resfinder却不能比对出突变造成的耐药基因。因此，将耐药细菌进行WGS，并通过Resfinder预测抗菌药物的药物敏感性还有一定的局限性。
综上所述，CRKP菌株同时携带多种耐药基因，呈现多重耐药表型，耐药形势十分严峻，应加强对其耐药监测，制定有效的医院感染控制措施，防止其播散流行。WGS在预测细菌耐药表型方面具有较高的应用前景，值得推广。
所有作者均声明不存在利益冲突
