研究发现肠道真菌在微生态系统中也发挥着重要的作用，通过直接作用于肠道或间接影响肠道细菌等途径对人体产生不同的影响。本文通过对肠道微生态中真菌及其产物对宿主健康的影响和真菌与细菌互相作用的现有研究进行详细综述，系统阐述肠道真菌与炎症性肠病、结直肠癌、HBV相关性肝病、代谢相关脂肪性肝病和酒精性肝病等肝肠疾病的关联，并提示了肠道真菌在人类疾病发生发展中的重要作用。
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微生物群是指与动植物共生的微生物生态群体，包含细菌、真菌、古细菌、病毒及其他微生物。其中，自然界中总的真菌大约有150万种，全球超过3亿人患过真菌相关性疾病，如肺曲霉病等[1]。迄今为止，绝大多数微生物组研究的重心在于微生态系统中的细菌与宿主互相作用及其对机体的影响。然而，肠道真菌是肠道微生物中不可忽视的部分。在人类肠道中，真菌有近70个属，超过184种，其中念珠菌属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)和分支菌属(Branch)是主要的种类[1]。近来微生态研究领域开始将目光聚焦在真菌上，其中《科学》杂志亟呼，研究真菌正当时[2]。本文是基于国内外相关研究，对肠道真菌群对于肠道细菌群的影响以及真菌与肠、肝疾病的关系进行综述。
真菌的存在形式多样，包括单细胞酵母、双态性真菌，以及多细胞真菌。而不同的培养条件和代谢方式下双态性真菌会呈现如丝状、酵母样的不同形式，提示着真菌在不同环境中有不同的状态和功能，产生不同的相互作用[2]。基因测序技术的急速发展在培养法的基础上为真菌种类的识别扩宽了道路。利用转录间隔区(Internal transcribed spacer, ITS)测序技术来鉴定胃肠道真菌可促进肠道真菌群的研究[3]。研究发现，在健康肠道中存在着念珠菌、酵母菌以及其他常见的真菌。为规范和系统化研究真菌，Tang等[3]开发并整理优化了目标宿主相关真菌(Targeted host-associated fungi, THF)数据库。与细菌16S测序相比，由于真菌18S rDNA检测相对丰度关联性出错率高，故基于18S rDNA的二代测序技术(Next generation sequencing, NGS)等标记基因测序技术还需进一步改进[4]。有研究提示，基于培养和扩增的宏基因组等方法可能是分析人类肠道真菌成分的一种新策略[5]。而在人类微生物组计划(Human microbiome project, HMP)的研究中，通过ITS2测序研究数据结果发现，人类肠道微生态中真菌多样性显著低于细菌多样性，并且志愿者同一个体内不同时间段及不同个体间的肠道真菌群落结构差异较大。年龄和性别也会导致胃肠道真菌种群产生差异，但在当前研究的大多数样本中都有特定几种真菌的存在，这为证明核心肠道真菌群的存在提供了有力的证据[4]。
全球每年至少3亿人遭受真菌疾病的侵害并且超过160万人死于与真菌相关的疾病。常见的致病真菌包括Candida、曲霉菌属(Aspergillus)、肺孢子虫(Pneumocystis)及隐球菌属(Pneumocystis)等[6]。这些真菌在免疫功能正常的健康个体中普遍存在，并处于一个动态平衡的状态。当人体出现免疫力低下、服用抗菌药物等情况时，潜在致病真菌会大量繁殖并引起局部感染甚至全身疾病。较为常见的真菌病包括隐球菌脑膜炎(Cryptococcal meningitis)、念珠菌败血症(Candidal septicemia)、播散性曲霉病(Disseminated aspergillosis)等，是临床及基础研究中的重点研究对象。由于抗菌药物的普遍使用甚至滥用，临床上较短时间内涌现出多重耐药的致病性真菌，并导致感染患者较高的病死率。除了加强新药研发、药物监管和疫苗研发等多种手段来控制真菌感染以外[7]，通过微生态调控手段改善肠道真菌群结构也是一个有潜力的研究方向。以往的微生态研究关注点都在细菌上，而肠道真菌微生态的紊乱越来越被认为是造成病理现象的原因。真菌微生态的稳定与失调是一个动态过程，在这个过程中免疫不断被扰乱和重塑，故针对肠道真菌群的干预具有调节宿主免疫稳态和治疗炎症疾病的潜力。Iliev和Leonardi[8]认为，肠道菌群失调是原核和真核微生物群落之间相互作用的复杂结果。目前肠道真菌群相关的研究还存在许多争议和不足，需要更深入和更高质量的研究对其作用机制进行阐释。
真菌毒素是真菌代谢的次生代谢产物，具有肝肾毒性、皮肤毒性、遗传毒性。毒素通过污染食物或产毒素的真菌定植于肠道进入人体，会导致肠道微环境紊乱进而影响宿主健康。真菌毒素有很多种，其中常见的类型如脱氧萎镰菌醇(Deoxynivalenol，DON)、赭曲霉素A(Ochratoxin A, OTA)、玉米烯酮(Zearalenone, ZEN)、富莫菌素B1 (Fumonisin B1, FB1)、黄曲霉毒素B1 (Aflatoxin B1, AFB1)和棒曲霉素(Patulin, PAT)等，这些毒素绝大多数都还没有被深入研究。现有的研究报道显示，真菌毒素可通过多种机制影响宿主健康，如DON、ZEN、OTA、FB1、AFB1和PAT就被认为能显著影响上皮细胞的完整性和功能。这些真菌毒素会通过诱导细胞死亡、单层细胞通透性增强、跨上皮电阻的降低、损害紧密连接(Tight junction, TJ)蛋白的表达、胞内定位和功能，以及有害应激源的转位来实现对肠道黏膜上皮的损害以及肠道菌群的影响[9]。DON属于单端孢霉烯毒素，是目前少有的已经被系统研究过的真菌毒素，主要作用于肠道、肝脏和大脑，并进一步影响神经内分泌、免疫反应、生长激素轴和能量稳态相关的中枢神经回路[10]。总而言之，更多的真菌毒素有待进一步被探究。
肠道真菌与免疫系统有着密切联系，两者互相影响但具体机制仍不明确。关于肠道真菌与宿主免疫功能的相关研究尚未成熟，控制肠道真菌免疫的机制仍然未知。在生命早期阶段，肠道真菌通过在出生后驱动CD45＋CD103＋RALDH＋细胞迁移到周围淋巴结并维持次级淋巴器官的容量参与了次级淋巴器官的成熟过程[11]。Willis等[12]对足月和早产儿进行了前瞻性队列研究，发现在出生前真菌就在肠道内定植并保持内稳态，这是人类生物学一大重要发现。单核吞噬细胞(Mononuclear phagocytes, MNPs)表达的趋化因子受体CX3CR1是启动肠道真菌固有和适应性免疫应答的关键因子之一。CX3CR1＋MNPs表达抗真菌受体，并以酪氨酸激酶依赖的方式激活抗真菌反应。CX3CR1＋MNPs可能介导了肠道真菌群和宿主免疫之间的相互作用，导致肠道真菌群的紊乱并加剧肠道疾病[13]。Moeller等[14]发现一种宿主来源的几丁质结合蛋白纤维蛋白原C结构域蛋白1(Fibrinogen C containing domain 1, FIBCD1)与肠道来源的真菌可直接结合，并证明了上皮特异性表达FIBCD1可显著减少真菌定植，以改善真菌驱动的肠道炎症。内源性色氨酸(Tryptophan, Trp)代谢物在哺乳动物的肠道免疫稳态中发挥着重要作用。Trp通过白介素-22(IL-22)依赖黏膜平衡反应提供对白念珠菌(Candida albicans)的定植抵抗和炎症的黏膜保护，并通过肠道菌群来影响宿主-真菌的共生状态[15]。Wheeler等[16]发现，抗真菌药物处理或接种某些典型的罕见真菌所引起的肠道真菌失调将导致机体过度免疫应答，证明了肠道真菌在免疫稳态中发挥了重要作用。辅助性T淋巴细胞17(Th17)是把双刃剑，一方面起到免疫保护作用，但也可能与免疫相关病理有关。肠道Th17细胞有抗原特性，白念珠菌可诱导人体产生Th17细胞反应从而调节肠道炎症[17]。真菌直接或通过细菌等媒介间接影响肠道免疫并进一步影响全身免疫系统，最近不断有研究发现肠道真菌和宿主免疫间新的关联与机制，但仍需更多研究的支持。
真菌是人类微生物群落的正常组成部分。宏基因组测序证实真菌数量占人类肠道微生物群的0.01%～0.1%[4]。真菌在肠道中所占比例极小，却对肠道及肠道细菌的影响甚大[18]。得益于NGS等技术的发展，肠道真菌群的相关研究也逐渐增多。真菌的直径和体积分别是细菌的10倍以上和100倍以上，故两者的衍生代谢物及生物量存在较大的差异。在抗生素处理的小鼠模型中，Dollive等[19]利用粪便定量PCR检测真菌和细菌的丰度，在未处理组中，小鼠肠道的真菌种类及相对丰度随着时间的推移产生了巨大变化，一旦使用抗生素抑制细菌后，细菌丰度下降了3个数量级以上，而相应真菌丰度增加了40倍以上。停止抗生素干预后，真菌丰度可逐渐下降，但仍比未使用抗生素干预前增高。
肠道真菌与肠道细菌以互利与拮抗的方式相互作用。真菌-细菌之间的相互作用可以分为以下三大类：互惠共生、偏利以及竞争[20]。自从1928年青霉素被发现开始，真菌-细菌竞争关系逐渐被揭开，至今竞争关系的研究是最多最全面的。互惠共生迄今只在克罗恩病(Crohn’s disease, CD)中被观测到，显微镜下可见混合生物膜中白念珠菌与黏质沙雷菌(Serratia marcescens)和大肠杆菌(Escherichia coli)共生[21]。目前发现肠杆菌科细菌对布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)和白念珠菌在小鼠肠道的定植有积极的影响[20]。而偏利关系存在于很多互作中，绝大多数都是细菌在真菌中获得好处。值得注意的是，大多数来自胃肠道的数据强调了细菌对真菌的有害影响，但关于真菌对细菌的负面影响知之甚少。只有一项研究报道白念珠菌产生的法尼醇可抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产生群体感应分子，以及抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生物膜的形成与完整[22]。肠道真菌与细菌以及与宿主免疫系统的相互作用是研究人员刚刚开始研究的有趣领域。虽然细菌和真菌的相互作用已经被证明，但其在人类肠道定植期间互相影响的确切机制仍不确切。肠道菌群失调是原核微生物群落及真核微生物群落之间的复杂互作所表现出的总体特征。Pareek等[23]通过检测不同国家不同饮食习惯的真菌定植情况推测出肠道真菌可能通过饮食代谢物介导细菌-真菌交互来促进肠道定植。Jiang等[24]认为某些真菌在特定情况下，例如在细菌菌群受到严重干扰时，可能会"替代"共生细菌发挥有益作用。
真菌与细菌有相似的表面生态位点，相互作用可直接通过物理接触或分子分泌进行，也可间接通过宿主免疫系统反应进行。肠道细菌可以通过免疫系统为媒介来影响真菌。例如，菌群色氨酸分解代谢物与芳香烃受体结合有利于维持依赖于IL-22的黏膜反应平衡，从而抑制白念珠菌的定植[15]。Fan等[25]在一项对小鼠的研究中发现，肠道微生物群中常见的多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)通过产生转录因子HIF1-α和抗菌肽LL-37激活免疫系统来保护宿主免受白念珠菌的定植。而在昆虫肠道中真菌感染下调了中肠抗菌肽和双氧化酶的表达，导致了肠道菌群的生态失调、细菌负荷显著增加、细菌多样性显著下降并加速了宿主的死亡[26]。共生真菌可以通过高度保守的甘露聚糖介导对黏膜组织损伤的保护和调整免疫细胞的反应，从功能上起到与肠道细菌相似的作用。通过白念珠菌或酿酒酵母单定殖，有效地逆转了在消除共生细菌时实验动物对结肠炎和A型流感病毒感染的敏感性[24]。艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)常伴有白念珠菌的过度增殖以及真菌多样性、丰度、均匀度的下降，而粪菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)能通过增加酵母菌和曲霉的比例改善肠道微生态治疗CDI[27]。总而言之，越来越多的研究展示出在肠道微生态系统中真菌和细菌间可通过多种复杂的机制互相作用。
CHB是HBV感染后导致的慢性肝脏疾病。CHB可产生一系列并发症，如肝硬化、肝功能衰竭甚至肝细胞癌等。肠道微生物群在CHB患者的免疫及代谢调节中发挥着重要的作用[28,29]。肠道菌群结构紊乱、肠道屏障通透性增加可通过肠-肝轴促进CHB及相关肝脏疾病的发展[30]。但当前国内外研究的重点在于肠道细菌群与CHB的关系，肠道真菌所发挥的作用很少被提及。现有的研究认为在慢性HBV感染发展的过程中，肠道真菌群的数量和种类会出现变化，并进一步增加真菌感染的风险。通过分离培养法和18S rRNA测序等研究发现，HBV携带者和健康志愿者肠道真菌多样性相似，但当进展为CHB、肝硬化后肠道真菌种类丰度随病情进展逐渐增加[31]。在乙型肝炎重症化的过程中，肠道真菌失衡也呈严重化趋势。在CHB患者免疫系统功能下降后，念珠菌属、曲霉菌属和未能培养真菌等作为肠道机会性致病真菌侵袭肠道造成真菌感染[32]。进一步研究慢性HBV感染与肠道真菌群的相互作用具有较高研究价值。针对肠道真菌群结构的调节有潜力通过控制肠道菌群失调、免疫紊乱等来改善CHB及相关肝硬化、肝衰竭等肝脏疾病。
酒精性肝病(Alcohol-associated liver disease, ALD)是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，包括一系列从肝脂肪变性到纤维化、肝硬化病理进行性发展的肝病。慢性饮酒会导致肠道通透性增加、改变肠道微生物组成，最终导致ALD的发生和发展。利用ITS测序，在小鼠模型中可发现慢性酒精处理可以导致肠道真菌过度生长以及血浆中葡聚糖水平升高。与健康个体和代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)患者相比，酒精性肝硬化患者对真菌的系统暴露和免疫应答相对增加。ALD患者的抗酿酒酵母抗体(ASCA)升高[20]。Lang等[33]在一项临床研究中发现，ALD患者真菌多样性降低，可作为提高生存率的治疗靶点。血清ASCA升高与ALD患者病死率升高相关，并可以用来预测ALD患者的预后。由于肠上皮紧密连接功能失调和细胞旁通透性增加，ALD的发展与真菌产物从肠道转移到体循环密切有关。真菌产物通过CLEC7A信号通路诱导Kupffer细胞分泌促炎细胞因子IL-1β。葡聚糖与CLEC7A在Kupffer细胞及特定细胞结合，可诱导肝脏炎症，从而促进ALD，最终导致肝细胞脂肪变性和细胞死亡[33,34]。除了间接导致肝病以外，有研究发现肠道真菌可直接损伤肝细胞。ALD患者粪便菌群中白念珠菌比例增加，其产生的多聚蛋白毒素ECE1的多肽-念珠菌素可直接损伤肝细胞，从而加剧ALD[35]。用抗真菌药物治疗小鼠可减少肠道真菌过度生长，降低葡聚糖易位，并改善ALD[34]。另外，肝硬化患者经常暴露在真菌环境下，例如肝硬化患者易感染白念珠菌引起自发性真菌性腹膜炎。由于肠道真菌与ALD有着密切的关系，调控肠道真菌可能是缓解ALD的有效策略。
MAFLD曾名非酒精性脂肪性肝病，是以肝脏脂肪堆积为特征的疾病[36]。MAFLD诊断以代谢功能障碍为基础，可与其他肝脏疾病共存，其疾病谱里包含由于代谢原因引起的脂肪肝、肝炎、肝衰竭、肝癌等。从人们对MAFLD认知的改变开始，相应的真菌与疾病相互作用的机制也需要进一步挖掘。肠道真菌可作用于肠道，通过肠-肝轴引起肝病的发展。Mar Rodríguez等[37]研究发现子囊菌门等真菌与代谢异常相关，相反接合菌门等真菌可防御代谢紊乱，这预示着真菌将成为代谢性疾病的治疗位点。作为肠道益生真菌，鲍氏酵母菌被证明不仅可使MAFLD小鼠的肝脂肪变性和炎症得到明显改善，还可以调节MAFLD小鼠肠道内大肠杆菌/拟杆菌的比例[38]。肠道真菌与MAFLD疾病相关研究国内外暂无较多进展，将来可进一步探究MAFLD与真菌的相互作用。
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)和CD，其确切的发病机制仍有待阐明，但肠道免疫系统针对肠道微生物的异常免疫反应被认为是其重要的病理机制之一。IBD患者肠道内的真菌多样性及丰度高于健康人群，表现为担子菌/子囊菌(Basidiomycota/Ascomycota)比例增加以及白念珠菌载量增长。CD患者粪便和肠道黏膜中的白念珠菌和马拉色菌(Malassezia)的总真菌负荷增加[39]。
在人类或动物模型中，许多研究探究了真菌在IBD发病机制中所发挥的作用。在UC患者中，固有免疫受体，如C型凝集素受体Dectin-1的基因CLEC7A对于不同类型的真菌免疫是必不可少的，其多态单体已被证实与UC患者的疾病严重程度有关[40]。Dectin-1的缺乏会抑制树突细胞的抗真菌免疫，使得热带假丝酵母菌定植，可导致NF-kB信号通路下调及IL-6分泌减少，这进一步影响肠上皮细胞的修复，使得宿主对IBD的易感性增加[1]。在CD的病程中，白念珠菌与近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)在炎性黏膜中的含量增高。由于IBD患者肠道免疫被真菌诱发，CD患者的抗真菌抗体水平增加。ASCA与IBD有关，可以识别包括念珠菌在内的其他酵母抗原。系统性ASCA免疫球蛋白IgG和IgA被认为是诊断CD的有效诊断标志，作为血清学标记物用于诊断及预测疾病。另外有研究表明，热带假丝酵母菌在CD患者肠道中含量的增加会导致炎症及ASCA水平的上升[41]。
肠道真菌干预逐渐成为治疗IBD中其中一项重要的辅助治疗，并且已有布拉氏酵母菌在临床中使用，可增强肠道对病原体的免疫。在以往治疗IBD时，抗真菌治疗仅是针对白念珠菌和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的感染，而近来研究报道，在IBD中使用如扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)等益生真菌有治疗效果，为后续治疗IBD提供了新思路[39]。例如，布拉地弧菌可通过激活过氧化物酶体增殖活化受体γ(PPA-γ)、捕获肠系膜淋巴结T淋巴细胞来改善IBD[42]。总而言之，肠道真菌与IBD的研究已经有一定的基础，在接下来的真菌研究中，可以继续重点研究益生真菌对IBD的影响及治疗可能。
结直肠癌是目前临床上第三常见的癌症。IBD患者自身也是结直肠癌的高危人群，而这类结直肠癌则被称为结肠炎相关性结直肠癌(Colitis-associated cancer, CAC)。关于结直肠癌与肠道真菌的研究也有一定基础，但不同的研究结论各异。适应蛋白CARD9对抗真菌反应至关重要，在人类中CARD9缺乏主要导致念珠菌感染。有趣的是，Bergmann等[43]研究发现CARD9通过诱导IL-1β蛋白的生成，从而加重了结肠癌的发生发展。而另一个研究则证实SYK-CARD9信号通路促进肠道真菌介导的炎症体激活，从而抑制结肠炎和结肠癌。另外在同样的模型中，Malik等[44]发现肠道共生真菌在结肠癌中具有保护性作用，Wang等[45]则发现肠道真菌失调对结肠癌有促进作用。这两项研究均表明肠道真菌是结肠癌中不可忽视的因素。这两个结论虽然看似矛盾，但由于真菌组具有个体差异性，进一步证明了微生物依赖于宿主作用的重要性和复杂性[46]。在晚期腺瘤中，镰刀菌属占比更为丰富，这意味着真菌定植能促进腺瘤的进展。肠道真菌与细菌的拮抗作用有助于结直肠肿瘤的发展。Coker等[47]研究发现结直肠癌真菌谱的特征是Basidiomycota/Ascomycota比例增高以及酵母菌、肺囊菌纲和马拉菌纲丰度的变化。肠道真菌群可能作为结直肠癌重要的生物标志物和治疗靶点。
肠道真菌作为肠道微生物群中一个极为重要的组成部分，其与肠道细菌的相互作用极其复杂并对宿主健康有重要的作用。最近研究者们开始将眼光逐渐聚焦到肠道真菌上，越来越多的研究证明肠道真菌在宿主的生理或病理状态中会通过直接或间接作用于全身各系统器官发挥重要的作用。这些作用具有两面性，既可能参与疾病的发生发展，也可改善宿主免疫稳态和炎症疾病，其中肠道真菌与肠、肝疾病之间关系甚密，针对肠道真菌群的研究可以进一步指导临床相关疾病的治疗。然而目前研究发现的肠道真菌对宿主健康产生影响的作用机制仍不足以充分揭示其在人体中发挥的重要效应，故肠道真菌相关的研究是继肠道细菌研究后的另一大需要跟进的研究焦点。
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