铜绿假单胞菌是呼吸系统疾病常见的病原体，然而痰培养时间长、敏感度较低，聚合酶链反应因成本高无法在临床上普及，故挥发性有机物检测有望成为灵敏、快速、便携、价廉的诊断方法。本综述主要对挥发性有机物检测在诊断呼吸系统疾病中铜绿假单胞菌感染的研究进行阐述，探讨目前存在的问题，并提出相关建议，为今后的研究和临床应用提供一定的参考价值。
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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)属于革兰染色阴性杆菌，是常见的呼吸道病原体，可引起囊性纤维化、支气管扩张症和慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患者的肺功能快速下降，导致症状反复急性加重、生活质量下降以及住院风险增加[1,2]。同时，PA常引起医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎[3]。此外，PA具有易定植、易变异的特点，并能形成有"保护作用"的生物被膜，具有对抗菌药物的耐药性和对宿主免疫系统逃避性的特点。因此，及早识别和诊断患者感染PA，有利于疾病的早期治疗和预后转归。
目前，临床上诊断PA引起肺部感染的方法通常是通过气道样本的培养，如咳痰或诱导痰、口咽拭子和支气管肺泡灌洗液，该方法劳动强度大，耗时数天，依赖于样本中初始细菌数，且易受其他微生物影响，敏感度较低。实验室可通过16S核糖体DNA的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)精确诊断PA的存在[4]，该方法可能比作为金标准的培养试验更准确，但PCR需要专业的人员、专门的实验室和设备，成本高，在临床上很难普及。
随着代谢组学的兴起，检测呼出气内挥发性有机物(Volatile organic compounds，VOCs)逐渐受到临床关注。呼出气中含有数千种VOCs，能够传递关于人类健康和疾病的大量信息，在呼吸系统方面，它正被用于筛查或诊断多种肺部疾病，比如哮喘[5]、肺癌[6]、肺结核[7]、COPD[8]及囊性纤维化[9]等。但此类研究在国内较少，且该方法在临床中的应用尚处于起步阶段，故本文通过对VOCs在呼吸系统疾病中诊断PA感染的研究进行综述，以期为科研工作及临床应用提供参考价值。
既往文献用于检测PA产生的VOCs的方法很多，比如气相色谱质谱联用技术(Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、电子鼻、质子转移反应质谱、选择离子流管质谱、气相色谱-离子迁移谱、二维气相色谱-飞行时间质谱、生物传感器及光腔衰荡光谱技术等等。其中，运用最多的方法是GC-MS和电子鼻。
GC-MS目前已被认为是一种成熟的分析复杂挥发性化合物、混合物的标准技术，可将VOCs离子化，而不同的VOCs具有不一样的质/荷比，到达色谱柱末端的时间不一致，因此可将它们进行分离和进一步分析。GC-MS具有优良的分离和分辨能力及高选择性，可对单个VOC进行检测，亦能实现对复杂VOCs的定性及定量测定，且取样量少，检出限可达纳克级，结果准确可靠。据报道[10]，运用GC-MS技术对囊性纤维化患者痰液的VOCs进行检测，可成功预测患者是否存在PA感染。GC-MS亦能区分肺癌患者和健康志愿者[11]。并且，对于细胞学检查阴性的胸腔积液患者，可根据其胸腔积液的VOCs排除恶性肿瘤，尽可能避免胸腔镜胸膜活检等创伤性较大的操作[12]。既往研究普遍认为GC-MS是检测VOCs的金标准，常将新研发的检测方法与其进行比较。但GC-MS价格昂贵、处理过程复杂，需要配备有精密的仪器和专业的实验室人员，这限制了其在临床中的应用，若该技术能进一步简化，将极大促进临床对于PA感染和肺癌的早期筛查和诊断。
电子鼻是一种模拟生物嗅觉的非侵入性诊断技术，由复合化学传感器阵列、模式识别算法组成，可将化学信号转变成为电信号进行识别。多项研究肯定了该技术的作用，其在COPD的稳定期和急性加重期都能成功地识别患者是否合并气道细菌感染[13]，也能够在囊性纤维化患者中[14]和体外的细菌培养皿中[15]识别PA感染，更可以准确地识别伴有PA感染的稳定期支气管扩张症患者[16,17]。与GC-MS比较，电子鼻不能精确鉴定VOCs的具体成分和含量，但其对病原菌的检测不需要复杂的样本处理，成本低、操作程序简单。故有研究强调，可利用GC-MS识别特定VOC的优点为电子鼻上特异性传感器阵列的微调提供信息[18]，从而提升电子鼻的性能，实现早期、快速、实时筛查及诊断。因此，电子鼻有望成为便携、被广泛应用的技术，但其是否能直接运用于临床诊断呼吸系统疾病合并PA感染，仍需进一步升级传感器技术和数据分析系统。
质子转移反应质谱是一种基于质子转移反应的化学电离源质谱，而选择离子流管质谱是一种将呼吸样本中的微量气体分子引入氦气载气中使其化学电离的技术。以上两种方法都能对代谢过程进行长达数小时的实时监测，具有高灵敏度、高通量及检出限低等优点，允许同时定量检测出多种VOCs，并且无需对样本进行复杂的预处理[19]。据研究[20]，运用质子转移反应质谱对体外培养物的VOCs进行分析，可对大肠杆菌、克雷伯杆菌、枸橼酸杆菌、PA、金黄色葡萄球菌和幽门螺杆菌进行区分。同时，选择离子流管质谱能成功地区分PA、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等11种与医院获得性肺炎相关的细菌感染，证明了该方法有可能发展为呼吸系统疾病中可行的即时诊断工具[21]。但质子转移反应质谱和选择离子流管质谱都不能确定具体物质，需借助GC-MS鉴定具体的成分。在此基础上，科研工作者们通过不断改进技术，形成了质谱系统的其他检测方法，如气相色谱-离子迁移谱、二维气相色谱-飞行时间质谱等，在此不再一一赘述。
在呼吸系统疾病中，早期发现和治疗PA感染至关重要，这与疾病的良好预后高度相关。尤其是在囊性纤维化患者中，使用严格的抗菌药物治疗方案进行早期干预可消除60%患者的PA感染，一旦进展为慢性感染则几乎无法根除[24]。目前，针对PA代谢产生VOCs的研究多关注于囊性纤维化患者，而对于支气管扩张症的VOCs研究较少。关于PA感染产生的VOCs种类繁多，本文就数种有代表性的气体进行阐述。
PA可产生一种甜葡萄味气体，经研究证实，该气味为挥发性有机化合物2-AA[25]。它是一种挥发性芳香族化合物，化学式为C8H9NO，分子量为135 g/moL，由色氨酸分解代谢途径分支而来的喹唑啉生物合成的中间产物。起初，Labows等[26]采用GC-MS技术对PA、洋葱假单胞菌、恶臭假单胞菌、腐臭假单胞菌、荧光假单胞菌及嗜麦芽假单胞菌的顶空气体进行测定，发现仅PA产生2-AA，而其他菌株中未能检测到。后来，Scott-Thomas等[27]对囊性纤维化患者的20株PA培养物进行体外培养，然后采用固相微萃取联合GC-MS分析，发现其2-AA浓度比健康人和PA未定植的囊性纤维化患者高，2-AA可作为囊性纤维化患者合并PA感染的生物标志物，且与患者肺功能进行性下降有关。此外，亦有研究收集中耳炎[23]、鼻窦炎[28]患者的脓液，在脓液样本产生的VOCs中检测到2-AA，并证明其可作为中耳炎、鼻窦炎患者合并PA感染的生物标志物。
除2-AA外，Labows等[26]发现PA还产生2-壬酮。随后，Savelev等[29]对72例囊性纤维化和支气管扩张症患者痰标本的顶空气体采用固相微萃取联合GC-MS分析，发现2-壬酮用于诊断PA感染的敏感度和特异度分别为72%和88%，当2-壬酮与2，4-二甲基-1-庚烯联合时可将敏感度提高至94%，而特异度仅为60%。更为重要的是，他们发现，2-壬酮与2，4-二甲基-1-庚烯、柠檬烯等17种VOCs联合后，鉴定PA感染的敏感度高达91%，特异度高达88%。由此可见，2-壬酮是诊断PA感染的生物标志物，但可能需要与其他VOCs联合才更有意义。近期，Phan等[30]开发了一种灌注肉类模型用于研究抗生素和过氧化氢对PA生长和代谢的影响，发现2-壬酮和2-AA均可作为PA感染的生物标志物，且可能是监测抗生素疗效的重要生物标志物。
氰化氢是另一种被广泛研究的化合物。对于氰化氢是否能用于PA鉴定，目前争议较多。一方面，Enderby等[31]对合并PA感染的囊性纤维化患儿和哮喘患儿的呼出气体选用离子流管质谱进行检测，发现前者的氰化氢浓度显著高于后者[13.5 (8.1~16.5) ppb比2.0 (0~4.8) ppb，P<0.001]，且氰化氢可作为囊性纤维化儿童伴有PA感染的生物标志物。Carroll等[32]对21例囊性纤维化患者痰液样本的顶空气体进行选择离子流管质谱分析，经统计发现，氰化氢浓度大于100 ppb预测PA感染的敏感度和特异度分别为68%和100%。Ryall等[33]运用氰化物电极检测PA阳性和阴性囊性纤维化和非囊性纤维化型支气管扩张患者新鲜痰液中的氰化物浓度，结果表明PA阳性患者的痰液中可检测到氰化物，并与肺功能受损有关，而PA阴性患者未检测出氰化物。但另一方面，Dummer等[34]采用选择离子流管质谱技术对慢性化脓性肺病(囊性纤维化和支气管扩张症)患者和健康志愿者的呼出气体进行检测，发现唾液过氧化物酶在口腔内产生的氰化氢增加了口腔的呼出浓度，且氰化氢浓度在被PA感染和其他微生物定殖受试者之间差异没有统计学意义，所以他们认为氰化氢不是慢性化脓性肺病中假单胞菌感染的生物标志物。甚至有研究在支气管扩张症和囊性纤维化患者的痰标本中没有检测到氰化氢的存在[29]。
另外，硫氰酸甲酯也是合并PA感染的标志。Shestivska等[35]对囊性纤维化患者的36株PA菌株进行体外培养，经固相微萃取后运用GC-MS对PA菌株产生的VOCs进行了分析，初步发现硫氰酸甲酯与囊性纤维化患者合并PA感染有关。Dryahina等[36]进一步利用离子流管质谱法对体外培养的PA、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱假单胞菌的挥发物进行检测，发现硫氰酸甲酯、氰化氢、2-壬酮及苯酚是PA的特异性VOCs，可根据它们区分出PA。Lawal等[37]也发现硫氰酸甲酯和1-十一烯是PA的特异性VOCs，但PA和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌混合时的特异性VOCs为二甲基二硫醚、二甲基三硫醚。需要注意的是，1-十一烯是PA在有氧条件下产生的VOC，当处于厌氧条件时产生的是2-十一酮[38]。
除了研究单一VOC或多种VOCs与PA感染的关系，部分研究尝试建立模型诊断呼吸系统疾病是否合并PA感染。Kos等[39]回顾了40篇文献，鉴定出241种VOCs，选择其中56种进行了进一步评估，对44例囊性纤维化患者纵向研究了1年，发现了其中13种VOCs，经统计发现，诊断成人患者PA感染的复合模型包括乙酸乙酯、柠檬烯、2-戊酮3-甲基、甲苯和2-丁酮，ROC曲线下面积为0.86 (95% CI 0.70~1.00)，诊断的敏感度和特异度分别为70%和100%。另一项研究[40]运用选择离子流管质谱技术比较了44例合并PA感染和29例不合并PA感染的囊性纤维化患者的呼出气体，发现在PA感染的囊性纤维化患者中，二甲基二硫醚和2-AA更高，而丁醇更低，该3种VOCs诊断PA感染的ROC曲线下面积为0.774(95% CI 0.667~0.882)，敏感度为82.8%，特异度为64.9%。
目前，国内外关于VOCs检测应用于判断呼吸系统疾病合并PA感染的研究尚存在一些问题。首先，在基础实验中，由于研究方式和实验条件未做到严格统一，例如选择的菌株基因型或生长阶段不同，在不同的生长条件(如培养基、培养时间和温度不同)进行培养，顶空采样时间、VOCs预富集方法和化学分析的类型等都不一致，以至于研究结果各异，研究之间的可比性有限。其次，多为体外研究，但PA在体内产生的VOCs可能与在体外产生的不同，两者甚至仅25%~34%的相似性，因为培养基可对VOCs产生影响[41]，所以不能用体外研究的结果对体内的VOCs进行完全推断。再次，在人体内，宿主和病原体之间的相互作用以及微生物种群之间的相互作用都会影响最终呼出气体的VOCs成分及含量，并且患者的年龄、性别、测试时间、近期饮食及药物使用情况等许多因素都会影响VOCs谱，使得VOCs的研究比其他方法更具有挑战性，而部分体内研究未考虑相关影响因素，未来研究在入组患者时应制订更严格的标准。
尽管如此，VOCs检测在呼吸系统疾病中用于诊断是否合并PA感染具有一定的可行性。首先，与传统方法相比，检测VOCs具有无创、耗时更短、过程更简便等优点，可实现快速、实时诊断甚至连续动态监测PA感染。其次，PA感染后产生的VOCs相对稳定。据报道，感染早期和晚期产生VOCs的含量和化学多样性没有变化，仅后期产生的部分挥发物的相对丰度降低[9]。再次，可通过在体外上调PA的代谢提高检出率。有研究表明，在培养基中加入适量浓度酪氨酸和缬氨酸可上调绿脓色素(PA的次生代谢产物之一)的产量[42]，或者通过二氧化碳纳米气泡促进阳离子(特别是亚铁离子)对PA的供给，可提高PA的生长和代谢[43]，未来研究可尝试采用以上方式上调VOCs的产生。最后，可不断改进设备以提高检测性能。据研究[44]，与Carbopack Y、X和Carboxen 1000相比，Tenax吸附剂在提取标准混合物和VOCs中具有更好的重复性和更高的敏感度。因此，未来研究可从细节上进一步改善技术的检测水平。
综上所述，在合并PA感染的呼吸系统疾病中检测VOCs有望成为常用的诊断方法，未来的研究可通过改良方法及技术、检测某种特异性VOCs或将数种VOCs组成模型，以提高诊断的敏感度和特异度，并且寻找操作简便、价格便宜的设备及材料，才能在临床上实现快速普及应用。
所有作者均声明不存在利益冲突
