血小板为血液循环中发挥止血与血管损伤修复功能的特殊细胞，为机体止血、血栓形成过程中的重要构成因素，其亦涉及机体的炎症反应、固有免疫、血管生成与肿瘤的远处转移等过程。目前已知的血小板生成机制中，骨髓造血干细胞(HSC)与祖细胞经一系列可控的分化、成熟过程生成巨核细胞，而巨核细胞通过生成长分支状的前血小板，延伸穿过骨髓血窦而释放血小板。骨髓腔、细胞外基质及血小板生成素(TPO)等各种细胞因子共同作用，促进巨核细胞分化和血小板生成，为巨核细胞分化的主要调控因素。认识与了解巨核细胞分化、血小板生成的机制，可以为血小板相关疾病的治疗提供坚实的理论基础。笔者拟就目前关于巨核细胞分化及血小板生成机制方面的新研究进展进行综述。
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巨核细胞起源于骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)，后者向巨核细胞系定向增殖与分化，成熟为多倍体大细胞，随后历经前血小板(proplatelet)形成、裂解、释放血小板进入血液循环的过程。该过程大致分4个阶段：①HSC自我更新与分化；②HSC分化为巨核系祖细胞；③巨核系祖细胞分化、增殖生成成熟巨核细胞；④血小板的生成与释放。健康成年个体每天约产生1×1011个血小板，即每天更新血小板总量的十分之一；在机体需求增加时该数量可以升高10～20倍，在外源性血小板生成素(thrombopoietin，TPO)的刺激下该数量还可以再增高5～10倍。血小板寿命约为7～10 d，最后在肝与脾被清除[1,2]。血小板在止血、凝血、维持血管完整性、血管生成、固有免疫、炎症反应、肿瘤生物学等过程中发挥着重要作用，其质与量的改变均会导致各种凝血障碍性疾病的发生。认识与了解巨核细胞分化、血小板生成的机制，可以为血小板相关疾病的治疗提供坚实的理论基础。笔者拟就巨核细胞分化、血小板生成机制的研究进展进行综述如下。
在经典的造血模型中，HSC分化为具有双向潜能的巨核系-红系祖细胞(megakaryocyte-erythrocyte progenitor，MEP)，MEP最终发育为成熟的红细胞与巨核细胞。近来，研究结果表明，通过单细胞RNA测序方法可以分离并鉴定出一群潜在的多潜能造血祖细胞，其同时具有向巨核系-红系与嗜酸-肥大细胞分化潜能，称为具有巨核系-红系及嗜酸-肥大细胞分化潜能的多能祖细胞(multi-potent progenitor cells with combined megakaryocyte-erythroid potential and eosinophil-mast cell potential，EMkMPP)，这群细胞的GATA-1基因呈阳性[3]。该研究结果证实，多潜能HSC在造血细胞分化的早期阶段，首先分化为GATA-1基因呈阳性HSC与GATA-1基因呈阴性HSC的2个分支，前者将继续分化为巨核细胞、红细胞、嗜酸性粒细胞及肥大细胞，后者分化为淋巴细胞、中性粒细胞与单核细胞。在该造血模型中，肥大细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞与红细胞均起源于共同的祖细胞，即EMkMPP[3]。
单细胞分析实验结果显示，CD150＋ CD41＋ LSK(Lin－ Sca1＋ c-Kit＋)细胞表达von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)基因，并且显示出较高的巨核细胞系分化潜能。这说明具备巨核细胞系分化潜能的HSC可能存在于具有长期造血重建功能干细胞(long time-hematopoietic stem cell，LT-HSC)中，其高表达vWF，为一种原始的、TPO依赖性的HSC亚群，并且其处于HSC分化的最早期阶段[4]。Haas等[5]提出，在小鼠表型特异性HSC库中存在一类被称为干细胞样巨核系定向祖细胞(stem-like megakaryocyte lineage-committed progenitor，SL-MKP)的细胞群，其高表达CD41及巨核细胞特异性mRNA。在炎症因子的刺激下，干扰素信号通路被激活，促使巨核细胞特异性mRNA合成相关蛋白，触发SL-MKP向巨核细胞分化，并且生成足量血小板补充机体所需。近年来，越来越多的研究证据表明，普通髓系祖细胞(common myeloid progenitor，CMP)可能由一组异质性的混合细胞群构成，其中包括可以单向分化为MEP或者巨核系祖细胞亚群。Paul等[6]在小鼠CMP中检测到表达巨核细胞相关转录因子基因的细胞亚群，而在MEP中却未发现这些基因表达。亦有研究结果证实，CMP中存在一组具有向巨核系祖细胞单向分化潜能的细胞群，其均表达CD42b[7]。
但是，上述大部分研究结论均基于小鼠实验结果得出，人类骨髓中是否存在类似SL-MKP、巨核细胞系单向分化潜能的祖细胞亚群尚有待进一步研究。由于人体内HSC数量非常少，约每1×106个骨髓细胞中仅存在1个HSC，其分离、纯化难度较大。通过相同细胞表面标志物分离出来的细胞群亦可能存在功能异质性，并且不能确定其是否由不同细胞系的祖细胞构成。系列倾向性造血干细胞(lineage-biased hematopoietic stem cell)尚未在人类造血系统中被鉴定出来，有待未来生命科学发展，新技术手段能够更精准地分离、纯化HSC，并且能做到追踪单个细胞体内移植后分化、发育的特点。
巨核细胞被认为是血小板的前体细胞，为骨髓有核细胞中体积最大，数量最稀少的细胞之一，约占骨髓有核细胞总数的0.01%[7]。巨核细胞的生成涉及诸多细胞内、外信号通路，主要受各种转录因子调控，已经被报道的相关转录因子包括GATA-1、FOG-1、GATA-2、FLI-1、PU.1、NF-E2及RUNX1等。位于骨内膜微环境内处于静止状态的HSC在转录因子GATA1、RUNX1、NF-E2及趋化因子基质衍生因子(stromal-derived factor，SDF)-1的作用下逐渐由骨内膜龛迁移至血窦旁，发育为形态上可以识别的巨核细胞。巨核细胞根据形态与分化程度可以分为原始巨核细胞、幼稚巨核细胞、颗粒巨核细胞、产血小板型巨核细胞。巨核细胞成熟过程中体积逐渐变大，细胞质增多，通过细胞核内有丝分裂(DNA复制但是细胞质不分裂)变成多倍体细胞，合成血小板特异性颗粒及细胞骨架蛋白，形成分界膜系统(invaginated membrane system，IMS)等。其中，IMS为一种与细胞膜相连续的复杂袋囊状或细管状膜结构，向内延伸渗入细胞质，广泛分布于巨核细胞内除细胞核周及细胞质边缘以外的全部区域，被认为是形成前血小板的膜储备池，其将巨核细胞的细胞质分割成许多小块状区域，这些小块状区域被称为"血小板领域"(platelet territory)，是血小板的形成中心。巨核细胞膜内陷形成前IMS，通过高尔基复合体的膜配送与内质网介导的脂类转运使得IMS不断扩大。IMS形成为巨核细胞成熟的特征之一。趋化因子SDF-1与成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)-4能促进巨核细胞成熟及血小板释放，该过程不依赖于TPO/c-MPL。肿瘤生长因子(tumor grow factor，TGF)-β1，血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)，α干扰素则抑制巨核细胞生成，减少血小板数量[8]。缺乏TPO/c-MPL的小鼠血小板水平低下，联合应用SDF-1及FGF-4可以促使小鼠巨核细胞向血窦运动，短时间内恢复外周血血小板数量[8]。
近年来，Stegner等[9]提出了新的巨核细胞分化模型，认为骨髓内绝大部分的巨核细胞栖息于血窦附近，可以直接与血管发生相互作用，成熟与幼稚的巨核细胞位置分布无明显差异。少量远离血窦的巨噬细胞随机分布于骨内膜下，几乎不出现迁移。这与目前认为的巨核细胞由骨内膜下迁移至血窦旁而逐渐分化成熟的观点相悖。研究者认为骨髓血管网络密集，血管间距离很近，近似为任意2个巨核细胞直径之和，限制了其活动的空间，因此巨核细胞成熟的过程中只需极少距离迁移即可以到达血管旁[9]。这种邻近脉管系统栖息的巨核细胞生成模式，有利于机体急需血小板时，能够快速增殖、补充血小板。由此有假说提出，骨髓中可能存在2个巨核细胞池，其一直接邻近血管，巨核细胞不需要发生迁移即可以迅速补充血小板；另一个分布于骨内膜下，储存着大量静止期巨核细胞或者造血祖细胞[9]。
血小板为小而无核的细胞碎片，直径约1～3 μm，在血液循环中呈特征性的双凸圆盘状，光镜下血涂片中观察到的血小板呈不规则状，是由于其接触玻璃片后伸出伪足所致。巨核细胞在细胞骨架驱动下细胞质凸起形成伪足伸入血管内，这些凸出的细胞质逐渐延伸变成细长的串珠样结构，被称为前血小板，该过程即为前血小板形成(proplatelet formation，PPF)。PPF依赖于细胞骨架中微管蛋白的重排与动力蛋白的驱动，这一过程中巨核细胞细胞质内的血小板特殊颗粒、细胞器、微管等同时被运输至前血小板中。前血小板在延长过程中不断弯曲并多次分支，生成类似于"树枝样分叉"状的结构，每个分支的主轴直径为2～4 μm，形成的多次分支状结构增加了游离前血小板数量。因此，前血小板可以被认为是很多条血小板生产线的集合。在血流剪切力等因素作用下前血小板的末端呈小片状脱落形成血小板进入血液循环。1个巨核细胞可以生成10～20个前血小板[10]。Nakagawa等[11]报道，在体外培养基中，2股流体以60°角度相交叉汇合作用于巨核细胞，与单股流体相比可以使血小板产量提高3.6倍，说明成角度汇合的流体更有利于血小板的生成，但是造成这种现象的原因尚不清楚。当绝大部分巨核细胞的细胞质均转变成前血小板后，其细胞核遂成为裸核并逐渐退化，最终被单核-巨噬细胞系统清除。
鞘脂类在巨核细胞分化与PPF过程中作为细胞骨架的调节因子之一发挥着重要作用。3-酮-二氢鞘氨醇还原酶(3-keto-dihydrosphingosine reductase，KDSR)为从头合成鞘磷脂的必需酶，KDSR的致病性基因突变可以导致严重的皮肤病，部分患者伴血小板减少症，其骨髓活组织检查结果显示巨核细胞过度增殖且发育异常[12]。培养上述患者骨髓中的CD34＋ HSC分化生成的巨核细胞表现出过度增殖伴PPF减少[12]。敲除KDSR基因的斑马鱼亦出现类似于人类血小板减少症的症状[13]。但是KDSR基因在PPF过程中的作用机制尚不清楚[13]。调控血小板生成的分子机制亦尚未阐明，有文献报道糖蛋白Ⅰb下游的细胞分裂控制蛋白(cell division control protein，Cdc)42/Ras同源基因家族成员(Ras homolog gene family member，Rho)A调节体内巨核细胞向血窦的迁移与跨内皮血小板生成，与野生型小鼠相比，敲除Cdc42或RhoA基因的小鼠表现出显著的血小板减少症症状[14]。
除了成熟血小板与细长的前血小板以外，2010年，Thon和Italiano[15]在研究血小板生成机制的体外实验中，最早发现并报道了一种出现在血小板生成的中间阶段的大圆盘状细胞，细胞直径为2～10 μm，将其命名为preplatelet。preplatelet的边缘盘绕着厚微管，能够可逆性转变成"哑铃形"前血小板，并且可以继续分裂成为2个独立的血小板。在血小板生成的最后阶段，当2个血小板被1个细胞质桥连接在一起时，血小板颗粒仍然在进行着转运分配。哑铃状前血小板与preplatelet之间的互相转变可能是为了在血小板释放之前进行血小板颗粒再选择与分配。该研究者给小鼠静脉输注体外培养的preplatelet，其可以在体内继续分裂生成血小板，但血小板体积分布曲线明显不对称，新生成的血小板直径大于普通血小板[15]。总而言之，前血小板与preplatelet均可以被认为是前体血小板阶段，二者间能可逆性相互转变，最终分裂为成熟血小板。
40多年来，传统PPF模型显示，巨核细胞利用微管滑动的驱动力将前血小板从细胞质延伸到骨髓血窦。然而，Brown等[16]研究发现，大多数巨核细胞以大凸起的形式进入骨髓血窦，而不是向前延伸出细长的前血小板。大凸起巨核细胞的迁移机制亦不同于前血小板的延伸。该研究者还发现，在体外，前血小板通过滑动致密的微管束而扩张；而在体内，在巨核细胞大凸起处没有微管束，但是在突起处的前缘，细胞膜之间存在多个融合点，因此提出细胞膜融合促使巨核细胞向血窦凸起。这一观点的提出彻底改变了对于体内血小板生成基础生物学机制的认识。
Kowata等[17]通过小鼠活体成像技术发现，在巨核细胞向血管伸出的凸起中，除大量前血小板外，亦能够观察到部分有别与典型前血小板特征的较厚的不成熟凸起及其片段，其内结构包括边缘区、内质网、IMS及排列混乱的微管序列。在机体急性血小板数量减少的情况下，这些不成熟的厚凸起及其片段显著增多，可以不依赖于PPF而直接生成血小板。近年来，Nishimura等[18]提出血小板生成的"巨核细胞破裂依赖性途径"(megakaryocyte rupture-dependent pathway)，该途径主要受炎症因子白细胞介素(interleukin，IL)-1α调控。在机体急需血小板的情况下，如急性炎症或者血细胞急剧减少等，血浆中IL-1α水平快速升高，IL-1α/白细胞介素受体(interleukin receptor，ILR)-1通过干扰细胞膜的微管结构，破坏巨核细胞膜稳定性，诱导其破裂增加血小板的生成，使血小板数量快速恢复，并且血小板生成量比依赖于PPF途径高20倍。但是，这些血小板存在微管结构的异常，在形态与机械性方面均不同于依赖于PPF、Fas配体诱导的巨核细胞凋亡通路所产生的血小板。
传统观点认为，骨髓为巨核细胞分化、成熟和生成血小板的场所。既往有零星报道，将胎肝源性与骨髓源性巨核细胞注入小鼠体内，其几乎特异性定位于肺，并且于早期即释放血小板(2 h内)，这提示肺可能亦为血小板的生成场所之一[19]。近年来，Lefrancais等[20]通过小鼠活体成像技术研究发现，流出肺循环的血液中血小板的含量高于流入肺循环者，而其内巨核细胞数却低于流入肺循环的血液，并且肺循环中分布着大量动态释放血小板的巨核细胞。巨核细胞能够从骨髓迁移至肺，体循环中约50%的血小板产生自肺，生成速率约为1×108个/h。在肺组织内血管外亦分布着各发育阶段的巨核细胞及造血祖细胞等细胞群，在血小板减少或骨髓HSC相对缺乏的情况下，这些祖细胞能够再次由肺迁移至骨髓，重建各血细胞系，补充血小板数。处于肺血管外的巨核细胞比血管内的体积更小，并且仅肺血管内的巨核细胞才具备释放血小板的功能[20]。骨髓、脾血管外的巨核细胞可以认为是巨核系祖细胞[20]。上述研究结果证实，肺亦为造血器官之一，为血小板生成的场所之一。
关于巨核细胞凋亡在血小板生成中的作用一直存在争议。既往研究认为，成熟巨核细胞经历凋亡、局灶性凋亡或旁凋亡促使细胞骨架重排实现血小板释放，而前血小板的形成依赖于内、外源性凋亡通路的激活[18,20]。Josefsson等[21]却提出相反观点，该研究发现敲除小鼠促生存蛋白BCL-XL后触发巨核细胞凋亡，却并没有促进血小板的生成。相反，敲除促凋亡蛋白BAX与BAK在化疗诱导的巨核细胞凋亡中起保护作用，同时保证了血小板的生成与存活。该研究结果证实，巨核细胞生成血小板并不依赖于内源性凋亡通路的激活，相反，内源性凋亡通路必须被有效抑制，使巨核细胞能存活，才能顺利生成前血小板。体内实验中，联合抑制BAK-BAX介导的内源性凋亡通路与Fas/Fas配体介导的外源性凋亡通路并不影响小鼠血小板的生成，亦说明巨核细胞凋亡并不是生成血小板所必需[22]。近年，有相关研究者提出，促凋亡通路与促生存通路在触发血小板生成方面占据同等重要的地位[23]。latrunculin为一种微丝解聚剂，亦为凋亡诱导剂，促进巨核细胞多倍体化，增加前血小板的生成。成熟巨核细胞经latrunculin处理后能释放更多的前血小板，然而其促凋亡基因(BAK、BAX、BNIP3、BNIP3L基因)与促生存基因(BCL-2、BCL-XL、IGF1R、CFLAR基因)的表达水平却同时增加[23]，这提示前血小板的生成过程中促凋亡通路与促生存通路同时被激活。
骨髓微环境的维度、硬度、基质成分等均介导了环境因素对血小板生成的作用。巨核细胞生长在硬度为30～60 Pa的三维甲基纤维素凝胶培养基时，比液体培养基、悬浮在凝胶培养基表面的二维环境中或者置身硬度很高(300～600 Pa)的三维环境中时，可以生成更多的前血小板[24]。三维环境扩大了巨核细胞与周围环境的接触面积，通过前血小板与微环境的相互作用，最终促进更多血小板的生成。巨核细胞从骨内膜下(硬度高的环境)到血管周围(硬度稍低的环境)的分布呈一定的成熟梯度规律[25]。巨核细胞处于类似于血窦等相对硬度更低的环境时有利于其分化、成熟，而不同于其他细胞(处于静止期具有自我更新功能的HSC)更偏好骨内膜下硬度更高的环境[26]。瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员(transient receptor potential cation channel subfamily V member，TRPV)4为一种机械敏感性离子通道，激活后可以触发Ca2＋内流、整合素β1活化与内化，以及AKT磷酸化等级联反应而促进血小板生成，该过程发生于巨核细胞黏附于较软的基质上时，在较硬的基质上时不能触发血小板生成。巨核细胞通过TRPV4感知细胞外基质环境硬度，在适宜条件下启动血小板的生成与释放[27]。细胞外基质蛋白为血管壁龛的主要成分，包括玻连蛋白、胶原蛋白(Ⅳ型)、纤维蛋白原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白及vWF等。血小板与巨核细胞表面均高表达胶原蛋白受体糖蛋白Ⅳ与整合素α2β1，后者介导巨噬细胞与胶原蛋白的结合，Ⅰ型与Ⅳ型胶原蛋白可以指引前血小板在脉管系统定向生长，抑制骨髓中未成熟的巨核细胞形成前血小板，阻止发育中的血小板在骨髓腔内提前释放。相反，玻连蛋白、纤维蛋白原、纤维连接蛋白等均已经被研究结果证实可以促进血小板的生成[28]。遗传性血小板减少症患者常见肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MYH)9基因突变，而MYH9基因编码的肌球蛋白ⅡA参与抑制巨核细胞发育及前血小板的形成，MYH9基因突变将导致生成有缺陷的肌球蛋白ⅡA，引起不成熟前血小板的生成，导致血小板生成缺陷[29]。
HSC与巨核细胞及其祖细胞间存在多种共同的细胞表面分子，如血小板生成素受体MPL、CXCR4、CD150、CD41等。TPO由多种细胞产生，包括骨髓基质细胞、脾细胞、肾小管细胞、肝细胞、肌肉细胞与脑细胞，其中肝细胞为血清TPO主要来源。TPO/MPL在HSC与巨核细胞的分化、发育、维持及增殖方面发挥着重要功能。在TPO刺激下，HSC通过调控、表达不同的转录因子(GATA1、FOG1、RUNX1、FLI1及NF-E2)而分化为巨核细胞。血浆中绝大部分的TPO结合于血小板表面的MPL，少部分与巨核细胞及其祖细胞结合。当血小板数量下降时，血浆中游离的TPO水平升高，刺激骨髓中造血祖细胞向巨核细胞系分化以生成更多的血小板。反之亦然，即形成血小板生成的负反馈调节[30,31]。近年来，有研究结果表明，巨核细胞成熟与血小板生成亦能够不依赖于TPO介导的信号通路，这提示存在另一条TPO非依赖性的巨核细胞系发育途径[32]。
除TPO以外，诸多细胞因子已经被确定可以刺激巨核细胞生成，包括IL-3、-6、-9、-11与干细胞因子(stem cell factor，SCF)等。虽然上述细胞因子的缺乏并不能直接影响TPO诱导的巨核细胞生成，但是在体外实验中，加入混合的细胞因子后可以刺激巨核细胞生成[33,34]。SCF在巨核细胞分化早期发挥促进细胞增殖的重要作用[35]。IL-3与TPO在促进巨核细胞分化上具有协同作用[35]。在炎症状态下，IL-6通过刺激TPO水平升高而促进PPF[36]。
C-C基序趋化因子配体(C-C motif chemokine ligand，CCL)5为IL-8家族成员，为C-C基序趋化因子受体(C-C motif chemokine receptor，CCR)5的配体。CCR5为一种表达于白细胞与巨核细胞表面的G蛋白偶联受体。CCR5亦为人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的受体之一，目前认为HIV相关血小板减少与巨核细胞表面表达的CCR5相关，CCR5拮抗剂maraviroc已被研究证实具有对抗HIV感染的效果[37]。将炎症因子刺激后的血小板上清液加入小鼠巨核细胞培养基中，能够迅速提升前血小板的生成量；应用重组CCL5后亦观察到了类似效应，而maraviroc处理后血小板生成量明显减少，并且呈剂量依赖性[38]。CCL5/CCR5信号通路通过活化AKT信号通路抑制巨核细胞凋亡，并且刺激其成熟而促进前血小板的生成。炎症状态时，活化的血小板分泌大量CCL5进入血浆，血小板源性CCL5能够直接刺激巨核细胞触发比依赖于TPO途径更为快速的血小板生成效应[38]。
综上所述，近年来对于巨核细胞分化、血小板生成的细胞与分子基础的研究取得了较大进展，使研究者对许多先天性或者获得性血小板相关疾病发病机制的认识有了更新的视角。近10余年来，研究者已经能够在体外将人诱导多潜能干细胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)，脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cell)，人胚胎干细胞(human embroyonic stem cell，hESC)，骨髓造血干细胞，脐带血干细胞(umbilical cord blood stem cell)，子宫内膜间充质干细胞(endometrial stromal stem cell)等诱导分化为巨核细胞。但是由于其血小板产量低、HSC来源有限、其他风险(hESC与iPSC具有潜在致瘤风险)等因素，这些血小板培养模式仍停留在实验室层面，无法大规模推广以应用于临床治疗。近年来，在巨核细胞分化方面的相关研究发现提示在大规模培养中离体生产临床级血小板的可能性，而细胞培养与血小板分离技术的进步将有助于改善生产的血小板的质量与产量。此外，TPO及其受体的发现已经为临床治疗血小板减少症提供了新手段，而针对TPO非依赖性的血小板生成机制可以开发出血小板减少症的潜在替代疗法。巨核细胞分化、血小板生成分子机制的相关研究尚需进一步深入研究，以更好地指导临床相关治疗。
所有作者均声明不存在利益冲突
