胰岛素的发现不仅是糖尿病历史上的大事，也是现代生物医学史上的大事，具有深远的意义^［1］。2021年是发现胰岛素100周年，发现胰岛素受体50周年，世界各国的学术期刊发表了很多纪念、回顾和评论的文章。读史使人明智，温故而知新。笔者简要回顾胰岛素的发现历史及百年来相关领域的认识历程，期望对广大年轻医师今后的临床和研究工作有所裨益。

在1921年之前，有若干研究为胰岛素的问世奠定了坚实的基础。1869年，年轻的德国学者Paul Langerhans（1847至1888年）在其博士论文中首次描述了胰腺中存在很多“小细胞团”（little heaps of cells），但当时未引起重视。1887年，法国内科医师Étienne Lancereaux（1829至1910年）报道了2例伴有胰腺萎缩的年轻糖尿病患者，认为患者糖尿病的根源在胰腺，故命名为胰源性糖尿病（diabète pancréatique，pancreatic diabetes）^［2］。1889年，2名德国学者Joseph von Mering（1849至1908年）和Oskar Minkowski（1858至1931年）发现狗胰全切可造成严重的糖尿病^{［2, 3］}。1892年，法国学者Edouard Hédon切除狗的胰腺，并将切下的部分胰腺移植到去胰腺狗的皮下，发现狗并无糖尿病，如果将移植的部分胰腺切除则出现糖尿病。同年，法国生理学家Marcel Eugène Émile Gley（1857至1930年）发现胰全切可引起糖尿病，但部分切除并不引起糖尿病或仅引起一过性表现^{［2, 3］}。这些研究进一步明确了胰腺在糖尿病中的重要作用。

1893年，法国病理学家Édouard Laguesse（1861至1927年）将Langerhans描述的胰腺内“小细胞团”命名为Langerhans岛（islets of Langerhans）以纪念Langerhans，并认为Langerhans岛可能分泌能调节碳水化合物代谢的物质^［2］。1901年，美国学者Eugene Lindsay Opie（1873至1971年）对糖尿病患者的胰腺作了细致的病理研究，将胰腺在糖尿病中的作用局限到胰岛，提出胰岛损害是造成糖尿病的原因^{［4, 5］}，这是糖尿病病因和发病机制研究的重大突破。

发现胰腺中的胰岛在糖代谢及糖尿病中的重要作用后，受法国学者Charles-Édouard Brown-Séquard（1817至1894年）器官治疗（organotherapy）思想的影响，一些学者尝试用胰提取物治疗糖尿病。据加拿大历史学家John William Michael Bliss（1941至2017年）统计，1890至1910年间世界各地有不下400位研究者在探索用胰提取物治疗糖尿病^［6］。19世纪90年代，Gley采用胰导管注射明胶的方法造成胰腺萎缩，将剩余胰腺组织提取物注射给去胰腺狗，可使尿糖减少，糖尿病症状改善，但他没有及时发表这些结果^{［2, 3］}。1893年，英国医师Neaville Wood尝试用胰酶制剂（zymin）治疗糖尿病^［7］，未获成功。同年，Caparelli给糖尿病实验动物腹腔注射胰提取物，结果葡萄糖尿消失^［2］。1907年，英国学者John Rennie和Thomas Fraser报道了他们在1902至1904年间用硬骨鱼胰岛治疗5例糖尿病患者的结果^［8］。1907至1908年，德国医师George Ludwig Zuelzer（1870至1949年）报道了胰提取物治疗糖尿病的动物实验和临床研究结果。德国Schering公司将George Ludwig Zuelzer的胰提取物命名为Acomatol，并于1908年获得德国专利（No.201383）^［2］。1914年7月第一次世界大战爆发，同年8月George Ludwig Zuelzer应征入伍，研究遂中断^［2］。有3个美国研究组，包括芝加哥大学的Ernest Lyman Scott（1877至1966年）、Rockefeller大学的Israel Simon Kleiner（1885至1966年）和Samuel James Meltzer（1851至1920年）、Rochester大学的John Murlin和Benjamin Kramer以及罗马尼亚生理学家Nicolae Constantin Paulescu（1869至1931年）在胰提取物治疗糖尿病方面也取得了部分成功^{［9, 10, 11, 12］}。

多伦多4人组Frederick Grant Banting（1891至1941年）、John James Rickard Macleod（1876至1935年）、Charles Herbert Best（1899至1978年）、James Bertram Collip（1892至1965年）在胰岛素的发现中起着关键的作用。

1920年，欧战归来的Banting在加拿大安大略的伦敦开了一间外科诊所，但诊务寥寥（每月只有2个患者）^［13］。为了维持生计，Banting于同年10月在当地一所医校（现在的西安大略大学）得到一份兼职教师的职位，并作为生理学教授Frederick R Miller的研究助手^［13］。1920年10月30日晚，Banting在准备讲义时读到出生于俄罗斯的美国医师Moses Barron（1884至1974年）在此前不久发表的一篇论文，文中描述了1个病例，结石阻塞了胰管，导致胰腺的外分泌部萎缩，但胰岛未受影响，患者无糖尿病；Barron指出，结扎动物的胰管，只要不损害胰岛，就不会引起糖尿病^［14］。这篇文章使Banting“灵光闪现（eureka moment）”，他认为此前多位学者用胰腺提取物治疗糖尿病不太成功的原因在于胰腺外分泌产生的消化酶在提取过程中破坏了胰岛产生的内分泌物质，他设想结扎狗的胰管，待胰腺萎缩、外分泌耗竭后再提取内分泌物质^［3，15］。Banting觉得找到了解决问题的窍门，激动不已。他找到Miller，但Miller无法提供实验支持，遂劝说Banting找时任多伦多大学生理系主任的苏格兰生理学家Macleod。Macleod在碳水化合物代谢方面享有盛名，曾于1913年出版过1本糖尿病专著。Macleod对Banting的设想起初是怀疑的，但被Banting的激情所感染，决定给他一个机会，为其提供实验所需要的资源。Macleod还派其学生Best担任Banting的助手。在Macleod的指导和规划下，Banting和Best于1921年5月17日开始了研究工作。实验并不顺利，2周里10只狗死了7只，但Banting仍坚持不懈。1921年7月30日，依照Macleod的指导，Banting和Best将胰管结扎狗萎缩的胰腺制成提取物，把5 ml提取物静脉注射给去胰腺狗，1 h内血糖从0.20%降到0.12%。8月3日的实验更为成功，Banting和Best深受鼓舞，将其胰腺提取物命名为“isletin”。Banting和Best还测试了肝和脾提取物，发现并无治疗作用。9月17日，他们还首次测试了皮下注射提取物的作用，但效果不佳。

1921年9月21日，Macleod从苏格兰度假归来。Banting当面汇报了实验进展情况，Macleod觉得难以置信，对部分数据提出疑问，并要求重复实验。Banting对此极为愤怒，随即和Macleod大吵了一架。在朋友的调解下，风暴暂时平息，但不和的种子已经埋下。Banting提出了一些要求，Macleod担心答应这些要求会影响其他研究，Banting威胁如不满足要求就离开，最后Macleod只好勉强同意。11月14日，Banting在多伦多大学的聚会上报告了其研究结果，Macleod在主持中详细介绍了Banting的研究并多次使用“我们”，引起了Banting的不满。

结扎胰管等待外分泌部萎缩需要较长的时间，极大地影响了实验进度。11月16日午夜2点，Banting再次灵光闪现，想到胎牛胰腺的外分泌部尚未充分发育，可以代替萎缩胰腺。第2天，Banting即改用胎牛胰腺制备提取物，并使用新的Berkefeld过滤器滤去细菌，这样可避免加热灭菌对内分泌物质的损害。胎牛胰腺的实验结果相当满意，这使得Banting进一步尝试新鲜的成年动物胰腺。12月8日，Banting切除了1只狗的胰腺，并将切下的胰腺制备提取物，然后将提取物回输到这只狗，结果血糖显著下降。

1921年12月30日，Banting等^［16］在第34届美国生理学会年会上首次报道了他们夏季动物实验的结果。与会人员问了很多问题，不少问题很尖锐，是知识储备有限的Banting难以回答的，博学的Macleod娴熟地回答了这些问题，这让Banting感到难堪。Macleod在回答中使用“我们”，更加重了Banting的不满，认为Macleod窃取了自己的成果。

和以前的学者一样，Banting的胰腺提取物也时灵时不灵，并不时引起严重的不良反应。Banting意识到自己和Best的提取技术不过关，遂请求Macleod邀请Alberta大学的生物化学家Collip参与研究。Collip对激素研究很感兴趣，且具有腺体分泌和制备组织提取物方面的知识，爽快地答应了Macleod的邀请。Collip的工作是独立于Banting的，但承诺和Banting相互分享数据。Collip从1921年12月12日开始工作，Macleod派他的另1位学生、Best的同学Noble作为Collip的助手。Collip借鉴了Banting和Best的提取方法，并做了改进。Collip采用问世不久的Shaffer-Hartman法测定血糖，该法用血很少，兔耳缘静脉采血即可满足要求。Collip用正常兔代替去胰腺狗来测试提取物的降糖效能，极大地提高了实验效率，并节约了成本。

Banting急切地希望将他的成果用于临床。1921年12月，Banting向多伦多总医院内科主任Duncan Archibald Graham（1882至1974）提出请求，但被拒绝。Macleod以他的声望说服了Graham。Banting要求第1次临床试验必须用他和Best制备的提取物。1922年1月11日，1名叫Leonard Thompson的13岁男孩接受了治疗，当天下午Jeffrey医师给患儿皮下注射了7.5 ml由Banting和Best制备的提取物（医院记录写的是“Macleod血清”），无明显疗效，而且注射部位出现了无菌性脓肿。显然，第1次试验失败了。与此同时，Collip夜以继日地工作，他使用酸化乙醇溶液进行提取，并摸索最佳的乙醇浓度。1922年1月19日深夜，Collip取得重要突破，他发现当乙醇浓度超过90%时，胰腺提取物中的降糖物质出现沉淀。Collip遂选择90%的酸化乙醇进行提取，这样可去除绝大部分杂质蛋白。Collip还发现他的提取物可以抑制酮体生成，并增加肝糖原。1月23日，Thompson接受了第2次治疗，这次用的是Collip的提取物，取得了非常好的疗效，血糖从0.520%降到0.120%，尿糖从71.1 g降到8.7 g，尿酮转阴，患儿的症状也明显改善。1922年2月又治疗了6例患者，均获得良好的效果。

1922年2月，Banting的动物实验结果首次在学术期刊发表^［17］，次月，7例患者的临床研究结果发表^［18］。4月，团队完成1篇论文，对此前所有结果进行了总结。在这篇论文中，根据Macleod的提议，将胰腺提取物中的活性物质称为“insulin”^［19］。1922年5月3日，Macleod代表研究团队在华盛顿召开的美国内科医师学会（Association of American Physician）年会上宣读论文（Banting因故没有出现），引起轰动，全体与会者起立鼓掌，为20年来首次。

Macleod等当时并不知道英国生理学家Edward Albert Sharpey-Schafer（1850至1935）在1916年已将胰岛中可能存在的具有降糖作用的物质命名为“insulin”，而比利时生物化学家Jan de Meyer（1878至1934）早在1909年就将胰岛中的降糖活性物质称为“insuline”。“insuline”和“insulin”均源于拉丁文insula（意为“岛”）^［2］。无论是Edward Albert Sharpey-Schafer的“insulin”还是Jan de Meyer的“insuline”都少有人知。由于“insulin”更符合激素的命名习惯（英文激素名称一般以-in为后缀），更由于多伦多研究组的轰动性成果，“insulin”变得广为人知并一直使用至今。

一个广为流传的说法是：Banting用结扎胰管使胰腺萎缩的方法巧妙解决了胰蛋白酶破坏胰岛素的问题，这是多伦多团队取得成功的关键^{［13，20, 21］}。早在1922年12月，Frangcon Roberts就尖锐地批评了Banting关于胰蛋白酶破坏胰岛素的论点^［22］。1954年，美国医师Joseph H. Pratt（1872至1956年）指出，早在1875年德国生理学家Rudolf Peter Heinrich Heidenhain（1834至1897年）就已发现新鲜胰腺提取物并无蛋白酶活性^［23］。显而易见，Banting一直引为自豪的“灵光闪现”是建立在错误认知基础上的。Banting作为年轻的外科医师，犯这样的错误是可以理解的。但Macleod作为著名的生理学家，也跟着Banting错误地以为结扎胰管让胰腺外分泌耗竭从而减少胰蛋白酶对胰岛素的破坏是一个创新，则让人难以理解。1936年诺贝尔奖获得者、著名生理学家Henry Hallett Dale（1875至1968年）曾以调侃的口吻说“胰岛素只能在主任有点傻的实验室里被发现（Insulin could only have been discovered in a lab whose director was slightly stupid）”^［24］。不过，正是这建立在错误基础上的坚定信念，加上机缘巧合，造就了1项医学史上罕有其匹的伟大发现。

团队合作可能是多伦多4人组成功的根本原因。Banting信念坚定，百折不挠，是成功的关键。Macleod慧眼识英才，并提供有力支持和指导，也起着重要的作用。在Macleod之前，Banting也找过其他人，这些人或者对Banting不屑一顾，或者无力提供支持。Macleod虽然开始也不热心，但最终还是为Banting的执着所打动，给Banting提供了放飞梦想的机会，是Banting的伯乐。

Macleod作为当时知名的碳水化合物代谢专家，参与了实验设计。在1921年6月14日Macleod离开多伦多之前，他对动物实验及血糖测定给予了具体的指导。在离开多伦多后，他通过信件对Banting的工作给予建议和指导。Macleod实验室的条件，尤其是在葡萄糖分析方面是很先进的。很多学者都认为葡萄糖测定方法的革新在多伦多团队的成功中起着重要的作用^［5，15］。多伦多团队之前的研究者所用的方法比较老旧，测定血糖需要20~30 ml血液，使得这些研究者通常以尿糖而不是血糖作为观察指标^［15］。Macleod实验室测定血糖采用的是1916年才问世的Lewis-Benedict法，所需血量很少（Collip加入后采用的Shaffer-Hartman法更加先进）。因此，Banting和Best可以直接观察血糖，尤其在评估静脉注射提取物的效应时明显较其他研究者先进。静脉注射作用很快，血糖快速降低，但尿糖变化可能不显著，需测定血糖才能评估效应。如果给Banting提供支持的不是Macleod这样的权威人士，Banting可能和其他研究者一样止步于半途。Banting当时对相关研究了解有限（成名后的Banting不止一次地表示文献读得太多是不可取的，甚至会造成思想混乱），仅凭热情和闯劲是难以成功的。没有Banting，Macleod可能永远不会获得诺贝尔奖。如果没有Macleod，胰岛素终将被发现，但发现者可能不会是Banting，发现时间也不会是1921年。

Macleod的成功还在于及时请来了Collip。多数学者认为，多伦多团队成功的关键在于提取技术的革新而不是Banting的“奇思妙想”。新的纯化技术使得提取物杂质更少，不良反应更小，作用更稳定，效能更强，这完全得益于Collip这位技术功底深厚的生化专家。如果没有Collip的加入，Banting不会比其他人走得更远（首次临床试验失败即是明证）。此外，Macleod还运用他的资源及时组织了临床试验（这是Banting难以做到的）。在1921年之前，没有任何1个研究组能拥有多伦多团队的配置：既有热情高涨的Banting，又有熟悉研究领域且能提供丰富资源的学术权威Macleod，还有擅长提纯工作的生化专家Collip，当然还要加上勤勉的Best。团队成员之间虽有矛盾，但能顾全大局，没有因为分歧而半途而废。正是这种天时（生化技术的发展）、地利（Macleod提供的研究条件）、人和（团队的协作），造就了这项伟大的发现，也使得Banting和Best这两位科研“小白”奇迹般迅速成为举世闻名的科学大师。

在胰岛素问世之前，糖尿病的治疗只能依靠控制膳食。德国医师Bernhard Naunyn（1839至1925年）倡导严格限制碳水化合物的膳食疗法，美国医师Frederick Madison Allen（1879至1964年）推荐低热卡低碳水化合物的饥饿膳食，给患者带来巨大的痛苦，且疗效不佳。当时，糖尿病患儿的生命是以周、日乃至小时计的^［25］。著名糖尿病学家Elliott Proctor Joslin（1869至1962年）1917年的资料显示，2/3的1型糖尿病儿童在诊断后1.4年内死亡^［26］。胰岛素的问世使得糖尿病的预后发生了翻天覆地的变化^{［25, 26, 27］}，大量的患者因为胰岛素的出现而免于死亡，同时告别了让其苦不堪言的饥饿疗法。Joslin甚至用“复活”一词来形容胰岛素治疗创造的奇迹。胰岛素的问世也极大地推动了生物医学的发展，开启了生物制剂治疗人类疾病的新纪元。

早期胰岛素治疗患者中最著名的可能是时任美国国务卿Charles Evans Hughes（1862至1948年）的女儿Elizabeth Evans Hughes（1907至1981年）。Elizabeth于1919年诊断为糖尿病，1922年8月辗转来到多伦多，当时体重只有45磅，濒临死亡。Elizabeth在Banting的治疗下迅速好转，此后正常读书、工作、结婚生子。Elizabeth在接受胰岛素治疗后活了58年，一生共注射胰岛素42 000次（美国作家Thea Cooper和Arthur Ainsberg将Elizabeth的经历写成小说，该书中译本于2011年出版）。

1923年10月25日，诺贝尔奖委员会宣布Banting和Macleod获得当年的医学生理学奖。胰岛素的发现如此快地获得诺贝尔奖，这在医学史上是少有的。获奖带来了巨大的荣誉，随之而来的是巨大的争议。争议首先发生在多伦多团队内部。Banting认为和他一起得奖的应该是Best而不是Macleod，遂将奖金的一半分给Best。Macleod认为Collip也应该得奖，将奖金的一半分给Collip。获得诺贝尔奖的喜悦没有冲淡Banting对Macleod的仇恨，他拒绝与Macleod同台受奖，在加拿大举行的庆功会上甚至拒绝与Macleod一起拍照。Banting在回忆文章中和各种场合下竭力淡化Macleod和Collip的贡献，并认为他们为了名利而窃取别人的成果，这使得人们在很长时间里都对Macleod持否定态度（尤其在加拿大）。1981年，前诺贝尔奖委员会主席、知名内分泌学家Rolf Luft（1914至2007年）在美国国立卫生研究院的演讲中就批评1923年诺贝尔生理学奖是委员会犯下的最大错误^{［28, 29］}，他认为Macleod不应获奖，应该获奖的是Banting、Best和Paulescu。

1982年，加拿大历史学家Bliss在仔细查阅相关档案材料、原始研究记录、回忆文章并走访相关健在人员的基础上撰写了《胰岛素的发现（The Discovery of Insulin）》一书^［6，30］，详细讲述了胰岛素的发现经过。Bliss以渊博的学识和锐利的眼光拨开历史的迷雾，还原了当年的场景，肯定了Macleod和Collip的贡献，给二人恢复了名誉。

Banting之前的研究者Zuelzer、Paulescu等也对胰岛素的发现权及诺贝尔奖的授予提出疑问，尤其是Paulescu。作为Lancereaux的学生，Paulescu有丰富的糖尿病知识。Paulescu从1907年开始相关的研究。1916年，Paulescu发现给去胰腺狗注射胰腺水提物可改善糖尿病。第一次世界大战结束后Paulescu重启研究，并于1921年8月31日在法语杂志Archives Internationales de Physiologie报道了相关结果^［12］。Paulescu将得到的胰提取物称为“胰素（pancreine）”^［12］。后世不少研究者仔细对比了Banting的论文和此前Paulescu的论文，觉得Paulescu才是最早发现胰岛素的人^［12］。还有人认为胰岛素是1914年发现的，发现者是德国的Zülzer和卢森堡的Camille Reuter（1886至1974年）^［31］。不过，Paulescu也好，其他研究者也好，都没有解决胰腺提取物不良反应大和降糖效应不稳定等问题，这些提取物难以用于临床，而多伦多4人组通过团队合作解决了这些问题，并提供了连续7例有效的临床证据，这是其他研究者从未取得的成绩。因此，将胰岛素的发现归功于Banting团队，他们因此获得诺贝尔奖是合理的。

刚发现胰岛素的时候并不清楚其化学本质，对其结构更是一无所知。1923年，Harold Ward Dudley基于胰岛素可被胃蛋白酶和胰蛋白酶灭活这一特点，猜测胰岛素可能是蛋白质^［32］。次年，因提出Somogyi现象而闻名的美国生物化学家Michael Somogyi（1883至1971年）和后来的诺贝尔奖获得者Edward Adelbert Doisy（1893至1986年）等再次提出胰岛素可能为蛋白质^［33］。1926年，著名学者John Jacob Abel（1857至1938年）成功制备了胰岛素结晶，进一步提示胰岛素为蛋白质^［34］。1935年，美国学者Hans Jensen和Earl A. Evans从结晶胰岛素中得到苯丙氨酸和脯氨酸，才最后确定胰岛素的蛋白质属性^［35］。

在Banting和Macleod之后，还有几项诺贝尔奖与胰岛素有关。1945年，英国科学家Frederick Sanger（1918至2013年）用自己建立的1-氟-2，4-二硝基苯（也称Sanger试剂）法测定了胰岛素N-端氨基酸，发现胰岛素有两个N-端氨基酸，分别为甘氨酸和苯丙氨酸，首次证明胰岛素由2条肽链组成^［36］。1951至1953年，Sanger完成了牛胰岛素B链和A链的氨基酸序列分析，使得胰岛素成为第1个解析了一级结构的蛋白质^{［37, 38］}，Sanger因此获得了1958年诺贝尔化学奖（1980年Sanger因DNA测序第2次获奖）。

Sanger获得的胰岛素一级结构正确吗？当时没有基因克隆技术，遗传密码亦未阐明，无法用分子遗传学手段鉴定Sanger的工作是否有误。如果根据Sanger公布的序列用化学方法人工合成胰岛素，不仅可检验Sanger的序列是否正确，而且可以解决当时临床无法用人胰岛素治疗的问题，并可能通过结构改建合成出较天然胰岛素更适合临床应用的胰岛素制剂。德国学者Helmut Zahn（1916至2004年）、美国学者Panayotis G. Katsoyannis（1924至2019年）在1963至1964年报道了胰岛素的人工合成^{［39, 40］}，1965年中国科学家完成了结晶牛胰岛素的全合成^［41］。1975年，瑞士Ciba-Geigy公司生产的全合成人胰岛素CGP 12831在6例患者中进行了为期2周的临床试验，除2例患者出现突然的低血糖外，其他患者均显示良好的耐受性^［42］。这些工作充分证明Sanger的测序结果是完全正确的。当然，随着基因工程技术的发展，人们对蛋白质化学合成的热情不断降低，用化学法合成蛋白质已无必要。

英国学者Dorothy Crowfoot Hodgkin（1910至1994年）和中国科学家梁栋材在阐明胰岛素的晶体结构方面作出了突出的贡献^{［43, 44］}。Hodgkin从1934年开始研究胰岛素晶体结构，但当时的技术难以解析像胰岛素这样的生物大分子，因而进展不大。Hodgkin此后因X射线晶体衍射术研究生物分子晶体结构而获得1964年诺贝尔化学奖。1969年，Hodgkin穷35年之力最终用X射线晶体衍射术解析了牛胰岛素的三维结构。1972年，梁栋材（1965至1967年在Hodgkin实验室进修）等获得2.5埃分辨率的三方二锌猪胰岛素晶体结构，次年又获得1.8埃分辨率的晶体结构，在国际上具有重要影响。

胰岛素的测定具有重要的临床意义。早年用生物检定法（bioassay）测定胰岛素，由此衍生出胰岛素单位^［45］。1922年，Banting等将胰岛素单位定义为“皮下注射2~4 h将正常空腹兔血糖降到0.045%的胰岛素量”，此即所谓“兔单位（rabbit unit）”。如果实验中使用的动物是小鼠，则称为“小鼠单位（mouse unit）”。1923年7月，联合国的前身“国联（League of Nations）”的标准化委员会对“兔单位”做了修改，将体重2 kg禁食24 h的兔在3 h内造成低血糖惊厥的胰岛素量定义为1个“兔单位”。胰岛素制剂的效能（potency）由每毫克含有的单位数决定。1925年，“国联”推荐1 mg胰岛素含有8 U（1 U=0.125 mg）。1959年，世界卫生组织生物标准化专家委员会规定1 mg=24 U，1986年修订为1 mg=26 U。2010年，世界卫生组织再次对胰岛素标准作了修改，规定1 mg=28.8 U或1 U=0.034 7 mg=0.6 nmol。由此得出的胰岛素浓度单位的换算公式为1  μU/ml（1 mU/L）=6.00 pmol/L（文献中另1种换算公式1  μU/ml=6.945 pmol/L是错误的）^［46］。

用观察正常兔血糖变化的方法测定胰岛素，敏感性很低，不能测定血浆（或血清）胰岛素浓度。1941年，Gellhorn等^［47］用去垂体-去肾上腺髓质大鼠测定血胰岛素浓度。1950年，Bornstein改用四氧嘧啶糖尿病-去垂体-去肾上腺髓质大鼠^［48］，提高了敏感性。1952年，Groen等^［49］用大鼠膈肌建立血胰岛素的体外测定法，较以前的动物实验简便且更敏感。1958年，Martin等^［50］改用大鼠附睾脂肪垫，进一步提高了敏感性。

生物检定法操作繁琐，敏感性有限，且干扰因素多。1959年，美国学者Rosalyn Sussman Yalow（1921至2011年）和Solomon Aaron Berson（1918至1972年）在研究血浆抗胰岛素抗体时建立放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）技术^{［51, 52］}。Yalow因此获得1977年诺贝尔医学生理学奖。RIA开微量测定之先河，此后各种微量测定技术不断涌现，极大地推动了生物医学的发展。

胰岛素的测定对糖尿病分型具有重要意义。1950年，Bornstein和英国著名糖尿病学家Robert Daniel Lawrence（1892至1968年）基于血浆胰岛素测定结果将糖尿病分为2种临床类型^［53］，一种血浆胰岛素几乎测不出，另一种血浆胰岛素浓度和正常人差异不大。胰岛素的测定还导致了胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）的发现。用生物检定法测定的人血浆胰岛素浓度远高于用RIA测得的胰岛素浓度，提示胰岛素可能不是血液中唯一的降糖激素。1963年，瑞士学者Froesch（曾获1967年Minkowski奖）等^［54］发现，在用生物法测定的人血浆胰岛素样活性（insulin-like activity，ILA）中，只有7%可被抗胰岛素抗体所抑制，称为可抑制性胰岛素样活性（suppressible insulin-like activity，SILA）；93%的血浆ILA不能被抗胰岛素抗体所抑制，称为不可抑制性胰岛素样活性（nonsuppressible insulin-like activity，NSILA）。Samann等^［55］将SILA称为“典型胰岛素（typical insulin）”，代表由胰岛分泌的胰岛素，将NSILA称为“非典型胰岛素（atypical insulin）”。NSILA的代谢调节比活性（specific activity）约为胰岛素的1/60，促生长比活性为胰岛素的50~100倍。1976年，瑞士学者Ernst Rinderknecht和René E.Humbel将人血清中的NSILA分为NSILA-Ⅰ和NSILA-Ⅱ两种，皆为多肽^［56］。1978年，Rinderknecht和Humbel完成NSILA-Ⅰ和NSILA-Ⅱ的氨基酸序列分析，结果显示二者与胰岛素有很高的同源性，因此建议命名为IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ^{［57, 58］}。IGF与胰岛素组成1个蛋白家族，其受体与胰岛素受体也属于1个家族。1983至1984年，Van Wyk实验室和Hall实验室先后证明生长介素（somatomedin，SM）-C、SM-A和IGF-Ⅰ是同一种蛋白质^{［59, 60］}，将NSILA的研究和SM的研究统一起来。

在胰岛素刚发现时，产量有限，供不应求。此外，最初的制剂存在很多缺点，如纯度不够（导致注射不良反应多发）、变异度大（经常出现低血糖）、存在退化现象（deterioration）等。为解决这些问题，Banting等和美国礼来公司合作。礼来公司的首席化学家George B. Walden（1895至1982年）发现胰岛素制剂里的活性成分在保存中会逐渐产生沉淀，使剩余的胰岛素效能降低，从而产生退化现象^［15］。Walden还发现，当pH值达到等电点时，胰岛素最易出现沉淀，将沉淀的胰岛素分离出来，再溶解，可大幅提高胰岛素的稳定性、纯度和效能。这种等电点沉淀（isoelectric precipitation）技术使得大规模生产胰岛素成为可能^［15］。1934年，多伦多大学Connaught实验室的David Aylmer Scott基于胰腺含锌量较高这一现象，猜想锌可能影响胰岛素，他在研究锌对胰岛素的影响时发现加入少量氯化锌可促进胰岛素形成结晶^［61］，进一步改进了胰岛素制剂的质量。

早期胰岛素制剂作用维持的时间较短。1935年，Scott和Fisher^［62］发现在胰岛素溶液中加入锌可使胰岛素作用时间延长。1936年，丹麦学者Hans Christian Hagedorn（1888至1971年）等^［63］发现在胰岛素制剂中加入碱性的鱼精蛋白（protamine）可延长胰岛素的作用时间。同年，Scott和Fisher^［64］发现在鱼精蛋白-胰岛素溶液中加入锌可使胰岛素作用时间进一步延长由此制成第1个长效胰岛素制剂鱼精蛋白锌胰岛素（protamine zinc insulin，PZI），其作用可维持24~36 h。1946年，诺和公司的研究人员开发出中性鱼精蛋白Hagedorn（neutral protamine Hagedorn，NPH）胰岛素，并于1950年上市。NPH胰岛素为中效胰岛素，较稳定，其鱼精蛋白和锌含量低于PZI（PZI中的鱼精蛋白是过量的），国内也称为低鱼精蛋白锌胰岛素。NPH胰岛素又称为isophane，意指鱼精蛋白和胰岛素的量“相等”，正好全部形成结晶，制剂中没有多余的鱼精蛋白或胰岛素。NPH胰岛素含有少量的锌和酚类，在中性pH值的条件下起稳定鱼精蛋白-胰岛素结晶的作用。NPH胰岛素有一个显著的优点，可和短效胰岛素混合而不影响彼此的作用。

1952年，诺和公司的Hallas-Møller等^［65］发现单独加锌亦可改变胰岛素的作用时间，由此形成3种不含其他蛋白的制剂，即超慢胰岛素（ultralente insulin）、慢胰岛素（lente insulin）和半慢胰岛素（semilente insulin）。超慢胰岛素作用时间较PZI更长，但起效需4~6 h。慢胰岛素也称为胰岛素锌悬液（insulin zinc suspension，IZS），为中效胰岛素。半慢胰岛素与可溶性胰岛素相似，属于短效胰岛素。超慢胰岛素、慢胰岛素和半慢胰岛素不能与其他胰岛素混合，随着胰岛素类似物和预混胰岛素的广泛应用，超慢胰岛素等在21世纪初退市。

临床应用的胰岛素制剂在很长时间都来源于动物，缺点是有一定的免疫原性。用化学合成的方法虽然可以得到人胰岛素，但成本太高。20世纪70年代，随着重组DNA技术的兴起，人们开始尝试用基因工程的方法生产人胰岛素。当时有2条技术路线：先克隆人胰岛素基因，再进行表达；或者直接化学合成人胰岛素基因再表达。1978年，Walter Gilbert实验室将克隆的大鼠胰岛素基因在大肠杆菌中表达，获得成功^［66］。同年Genentech公司的Goeddel等^［67］用化学方法合成了人胰岛素A链和B链基因（人胰岛素基因当时尚未克隆），并在大肠杆菌表达，再将纯化的A链和B链连接成完整的胰岛素。1982年，礼来公司的重组人胰岛素Humulin上市。20世纪90年代后，多种胰岛素类似物相继上市^［68］，胰岛素注射装置也不断改进。目前已有胰岛素周制剂（icodec）问世^［69］。

外源性胰岛素与生理性胰岛素的显著不同是其不受葡萄糖的调节。目前已有学者开发葡萄糖反应性胰岛素（glucose-responsive insulin）或葡萄糖敏感性胰岛素（glucose-sensitive insulin）^［70］。

胰岛素的生物合成遵从蛋白质生物合成的一般规律。但和一般蛋白质不同的是，胰岛素有A、B两条链。A、B两链是独立合成再组装为胰岛素，还是先合成一个前体，裂解成两条链后再组装，这在20世纪60年代末之前并不清楚。20世纪60年代中期，由于胰岛素的化学合成是先独立合成A、B两链再组装，因此学术界倾向于认为胰岛素生物合成也是如此。但美国学者Donald Frederick Steiner（1930至2014年）通过细致的研究证明事实并非如此。1967年，Steiner发现胰岛素瘤细胞除胰岛素外还产生1种分子量比胰岛素大的蛋白质，且这种蛋白质在化学上和免疫学上和胰岛素相关^［71］。Steiner随后提出胰岛素原假说，认为胰岛素的A、B两链来自同一前体，即胰岛素原（proinsulin），胰岛素原再加工处理为A、B两链，通过二硫键形成胰岛素^{［72, 73］}。1977年Ullrich等^［74］成功克隆大鼠胰岛素基因，1980年Bell等^［75］成功克隆人胰岛素基因，证明Steiner的假说是完全正确的。Steiner的研究具有重要的生物学意义。此后的研究显示，很多肽类激素都是先合成激素原（prohormone），再由激素原转化酶（prohormone convertase）等加工、处理为有活性的激素。Steiner的研究还导致了C肽的发现^{［72，76］}。

在20世纪60年代之前，有关胰岛素作用机制的研究多局限在对其生理作用的描述上，如有人提出己糖激酶假说，认为胰岛素可激活己糖激酶增加葡萄糖的利用。也有人提出通透性假说，认为胰岛素可增加细胞膜对葡萄糖的通透性而促进葡萄糖进入细胞内。20世纪60年代以后，随着受体学说的兴起，大多数学者认为胰岛素可能通过胰岛素受体发挥作用。但当时对胰岛素受体的本质并不清楚，有些学者认为胰岛素受体位于细胞膜上，也有学者认为胰岛素需进入细胞内才能发挥作用。1969年，Pedro Cuatrecasas证明胰岛素通过细胞膜发挥作用，不需要进入细胞内^［77］。1971年，Cuatrecasas和Freychet等分别证明脂肪细胞和肝细胞细胞膜存在胰岛素受体^{［78, 79］}。受第二信使学说的影响，当时不少学者试图找到胰岛素的第二信使，但一直没有成功。

1982年，Carl Ronald Kahn实验室的Kasuga等^{［80, 81］}发现胰岛素可刺激胰岛素受体酪氨酸残基发生磷酸化。1983年，Kasuga等^［82］发现胰岛素受体具有酪氨酸激酶活性，揭开胰岛素分子机制研究的新纪元。1985年，Ullrich等^［83］和Ebina等^［84］克隆了胰岛素受体基因，为胰岛素受体信号转导的研究奠定基础。1987年，Kahn实验室的White等^［85］发现胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）-1，此后，IRS2、IRS3和IRS4相继被发现。1990年，Ruderman等^［86］发现胰岛素可激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）。1994年，Kahn实验室的Cheatham等^［87］证明胰岛素的代谢作用由PI3K介导。1995至1996年，Kohn等^{［88, 89］}证明胰岛素可激活Akt，且Akt的组成性激活可促进脂肪细胞摄取葡萄糖。1997年，Alessi等^［90］和Cohen等^［91］发现3-磷酸肌醇酯依赖的蛋白激酶-1（3-phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK1），并提出PI3K-PDK1-Akt通路是胰岛素调节代谢的基本机制^{［90, 91］}。此后，胰岛素受体后信号转导的研究不断深入，目前已基本阐明其分子机制^{［92, 93］}。

作为体内唯一的降糖经典激素，胰岛素是生物进化的“杰作”，是大自然赐予人类的“瑰宝”。一百年来，人类对胰岛素的研究取得极大的成就，这些成就不仅造福了广大的糖尿病患者，也极大地推动了整个生物医学的发展。科学的发展永无止境，胰岛素的研究亦是如此。胰岛素和胰高糖素样肽-1受体激动剂的双激素制剂即将上市，胰岛素周制剂、受葡萄糖调节的“智能”型胰岛素、闭环式胰岛素泵在不久的将来也会面市。另一方面，随着小分子胰岛素受体激动剂、干细胞源β细胞研究的进展，也许糖尿病患者在未来的某一天可以告别注射胰岛素，转向“不用胰岛素的胰岛素治疗”。让我们共同努力，争取这一天早日来临。