视网膜新生血管常伴随微小RNA(miRNA)表达水平的变化。实时定量PCR是miRNA表达谱分析的常用方法，但内参基因在不同实验条件下可能呈现出差异性表达，如果以表达水平有显著波动的管家基因作为内参基因，可能会影响目的基因表达的结果评估，确定稳定表达的内参基因是进行后续研究的前提。
比较氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠眼球组织中常用的miRNA内参基因及其他几种内参基因表达水平的差异及稳定性，筛选在OIR模型和正常发育条件下均稳定表达的最佳miRNA内参基因。
应用随机数字表法抽取正常清洁级C57BL/6J P7、P12、P17、P37不同日龄小鼠及成年鼠(8周龄)各10只，小鼠在相应时间点颈椎脱臼法处死，收集眼球组织，应用实时定量PCR技术检测用于评估核小分子RNA U6(RNU6)、5S核糖体RNA(5s rRNA)、核仁小分子RNA U68(U68)、核仁小分子RNA U70(U70)、核仁小分子RNA U49A(U49A)5种内参基因在正常发育的不同日龄(P7、P12、P17、P37及成年)小鼠中表达的动态变化；另选取P7幼鼠40只，采用随机数字表法随机分为OIR组和正常对照组，每组20只。正常对照组小鼠在正常氧环境下饲养，OIR组小鼠在体积分数(75±2)%的高氧环境中饲养10 d。分别选取P17 OIR组和正常对照组小鼠各5只，进行球后静脉荧光素视网膜血管造影，并制备视网膜铺片，另各取5只小鼠处死后制备视网膜切片行组织病理学检查，以验证是否造模成功。然后应用实时定量PCR技术检测上述5种内参基因在正常对照组和OIR组小鼠视网膜组织中的表达差异；应用GeNorm程序对内参基因表达的稳定性进行分析。
在不同日龄正常小鼠视网膜中，内参基因U68的表达水平变化最大，其次为U49A、U70、RNU6、5s rRNA；内参基因U68、U49A、U70、RNU6在不同日龄小鼠视网膜中的相对表达量的总体差异均有统计学意义(U70：F＝7.005，P＝0.000；U68：F＝10.189，P＝0.000；U49A：F＝21.134，P＝0.000；RNU6：F＝4.968，P＝0.004)，而5s rRNA在不同日龄小鼠视网膜中的相对表达量差异无统计学意义(F＝2.099，P＝0.107)。P17 OIR组小鼠视网膜铺片显示，视网膜血管迂曲，可见视网膜无灌注区，苏木精–伊红染色可见突破视网膜内界膜的新生血管芽，而正常对照组小鼠视网膜均正常。在P17 OIR组小鼠内参基因U70表达水平变化最大，其次为U49A、U68、5s rRNA；U70、U49A、U68、5s rRNA在OIR组和正常对照组小鼠视网膜中表达量的差异均有统计学意义(t＝5.174，P＝0.000；t＝3.376，P＝0.012；t＝4.802，P＝0.000；t＝2.856，P＝0.029)，RNU6的相对表达量在2个组间的差异无统计学意义(t＝2.104，P＝0.065)。GeNorm程序分析结果显示，不同日龄的正常小鼠眼球中所选内参基因表达稳定度为5s rRNA/RNU6>U70>U49A>U68，最佳内参基因组合为5s rRNA和RNU6；在P17 OIR组小鼠眼球组织中所选内参基因的表达稳定度为5s rRNA/RNU6>U68>U49A>U70，最佳内参基因组合亦为5s rRNA和RNU6。
应用实时定量PCR技术研究miRNA基因表达时，应根据不同的研究对象和处理条件选择合适的内参基因。在OIR模型中，综合考虑发育、缺氧等因素的影响，在条件允许的情况下可优先选择5s rRNA和RNU6组合作为小鼠眼球组织miRNA表达分析的内参基因。
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微小RNA(microRNA，miRNA)是近年来发现的一类内源性非编码单链小分子RNA，长度约为22 nt，由具有发夹结构的单链RNA前体经Dicer酶加工后生成。虽然这类RNA不编码蛋白质，但可以在转录后水平通过与靶mRNA的3'端非编码区(3'-untranslated region，3'-UTR)进行互补性结合，导致靶mRNA的降解或翻译抑制，从而调控基因的表达[1]。研究表明，在眼部组织表达的miRNA可达百余种，其表达具有组织和发育阶段特异性，在缺血、缺氧条件下以及小鼠发育过程中，眼球组织的miRNA表达水平可能呈现出差异表达特性[2,3]。因此，对眼部组织miRNA的表达谱进行分析有利于发现miRNA和眼部疾病的关系，为相关疾病发病机制的研究和疾病防治靶点的选择提供参考。实时定量PCR技术因其灵敏性高、特异性强、检测快速且准确等特点，已成为miRNA表达谱分析的常用方法。在实时定量PCR检测中，为了排除初始反应物的量、反应效率、样本纯度以及加样差异等因素对结果的影响，须选择稳定的内参对miRNA的表达水平进行校正[4,5]，但在所有组织、细胞中以及不同条件下均能稳定表达的理想内参基因是不存在的，因此筛选特定条件下稳定表达的内参基因是进行miRNA表达谱分析的前提[6]。本研究通过实时定量PCR和GeNorm程序检测分析常用的5种miRNA内参基因，核小分子RNA U6(snRNA U6，RNU6)、5s核糖体RNA(5s rRNA)、核仁小分子RNA U68 (snoRNA U68，U68)、核仁小分子RNA U70(snoRNA U70，U70)、核仁小分子RNA U49A(snoRNA U49A，U49A)，在正常发育的不同日龄和出生后17 d(P17)氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)模型小鼠眼球组织中的表达状况，比较各内参基因在小鼠眼球中表达水平的差异及稳定性，筛选出缺氧和正常发育条件下稳定表达的最佳miRNA内参基因。
