滤过道瘢痕化及人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增生是抗青光眼滤过手术失败的主要原因。目前已有羟喜树碱诱导成纤维细胞凋亡及其机制的相关报道，但是羟喜树碱对HTFs自噬的影响鲜见报道。
探讨羟喜树碱对体外培养的HTFs自噬的影响。
收集3例接受斜视手术患者的Tenon囊组织，以组织块培养法，用含体积分数10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基原代培养HTFs并传代，取第3～6代细胞进行培养。分别在培养基中加入0.0、0.5、1.0、4.0、10.0 mg/L羟喜树碱，继续培养HTFs 24 h，以细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞的增生情况。选取4.0 mg/L羟喜树碱作用HTFs 24 h，用Cyto-ID自噬检测试剂盒进行荧光染色，观察各组细胞中自噬小体和自噬溶酶体成分的分布，用荧光显微镜和流式细胞仪分别对Cyto-ID染色阳性细胞数量及其荧光强度进行测定，并与对照组比较。用逆转录定量检测PCR(qRT-PCR)和Western blot法分别检测各组HTFs中自噬相关蛋白Beclin-1、自噬相关基因5(ATG-5)和微管相关蛋白1轻链3(LC-3)蛋白及其mRNA的相对表达水平。
随着羟喜树碱质量浓度的增加，HTFs细胞活力逐渐下降，0.0、0.5、1.0、4.0、10.0 mg/L羟喜树碱组HTFs细胞活力的总体差异有统计学意义(F＝19.040，P<0.001)，1.0、4.0、10.0 mg/L羟喜树碱组HTFs的细胞活力均低于对照组，以10.0 mg/L组最低，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。qRT-PCR检测显示，4.0 mg/L羟喜树碱组HTFs中Beclin-1 mRNA、ATG-5 mRNA和LC-3 mRNA的相对表达量分别是对照组的(3.225±0.346)、(2.839±0.418)和(3.761±0.224)倍，与对照组比较差异均有统计学意义(P＝0.020、0.027、0.007)。Western blot检测表明，4.0 mg/L羟喜树碱组HTFs中Beclin-1、ATG-5和LC-3蛋白表达的灰度值较对照组明显上升，LC-3Ⅱ/Ⅰ灰度值比值分别为0.965±0.159和0.275±0.860，差异均有统计学意义(P＝0.003)。Cyto-ID染色结果显示，4.0 mg/L羟喜树碱处理后，HTFs自噬阳性细胞的比例由未处理的(11.333±4.010)%上升到(55.000±9.013)%，差异有统计学意义(P＝0.002)。流式细胞仪检测表明，4.0 mg/L羟喜树碱处理后24 h Cyto-ID染色的平均荧光强度是对照组的(3.037±0.513)倍，差异有统计学意义(P＝0.003)。
羟喜树碱能诱导体外培养的HTFs发生自噬。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
抗青光眼滤过手术是目前青光眼治疗的重要手段，术后滤过道瘢痕化是导致手术失败的主要原因。有报道显示，抗青光眼滤过手术中联合使用抗代谢药物丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)，术后5年的失败率仍达30%，低眼压、滤过泡渗漏、黄斑病变、眼内炎等为其常见的并发症[1,2]。因此，亟需研究安全、高效、不良反应少的药物来抑制手术区成纤维细胞的增生，减轻滤过道瘢痕化，提高滤过手术的成功率。羟喜树碱是S期特异性细胞周期阻断剂，通过抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ起到抗肿瘤的效应[3]。本课题组的前期研究证实，小梁切除术中局部应用羟喜树碱能够减轻滤过道瘢痕化，提高手术成功率[4]。此外，羟喜树碱能抑制体外原代培养的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon capsule fibroblasts，HTFs)增生，诱导其凋亡[5,6,7]。自噬是真核细胞进化过程中高度保守的一种生命现象，细胞可以通过自噬清除老化受损的亚细胞器和清除长寿蛋白而获得更新。在细胞饥饿、损伤、缺氧和生长因子缺乏等条件以及某些病理状态下，自噬对维持细胞的存活有保护作用，过度的自噬可以导致细胞出现程序性死亡[8]。在某些因素，如抗代谢药物的刺激下，细胞的自噬和凋亡现象可以同时被观察到[9]。因此我们提出假设，羟喜树碱在诱导HTFs凋亡的同时，对另一种程序性细胞死亡方式–自噬也可产生一定的影响。本研究探讨羟喜树碱是否能诱导HTFs发生自噬，从而为其在抗青光眼滤过手术中的应用提供新思路。
